范 璐，周亞利，霍權(quán)恭，朱桃花，王彩霞，趙忠華，焦愛琴

（1.河南工業(yè)大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.濮陽(yáng)市糧油質(zhì)量檢測(cè)中心，河南 濮陽(yáng) 457000）

0 引言

天然植物油脂是成分十分復(fù)雜的混合物，對(duì)其進(jìn)行分離是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性的工作，食用植物油脂理化性質(zhì)的相似性為識(shí)別分析帶來了極大的困難.隨著相關(guān)學(xué)科的發(fā)展，特別是隨著現(xiàn)代儀器分析技術(shù)的發(fā)展，對(duì)油脂的識(shí)別分析在深度和廣度上取得了許多新進(jìn)展[1-2].利用油脂的光譜信息，如使用紫外-可見光譜法[3]、紅外和近紅外光譜法[4-6]、熒光光譜法[7-9]等，對(duì)植物油脂的識(shí)別分析均取得了一定的成效，但受油脂加工的影響，油脂的非甘油三酯成分會(huì)發(fā)生較大改變，使用光譜法受其影響較大.利用油脂的脂肪酸特征，如氣相色譜法分析各種油脂的脂肪酸組成和含量[10-12]，也是油脂識(shí)別分析研究的熱點(diǎn)之一，而不同油脂的混合可能導(dǎo)致脂肪酸組成相似，這給識(shí)別分析帶來新的問題.

甘油三酯是天然植物油脂的主要成分.甘三酯的組成受品種因素控制較多，因此，可以依據(jù)甘油三酯的甘油骨架上結(jié)合的脂肪酸的種類以及脂肪酸的分布及構(gòu)型，來識(shí)別植物油脂種類.依據(jù)甘三酯識(shí)別分析不同的油脂，建立方法面臨以下問題，一是需要采用合適的高效液相色譜條件，將不同油脂的甘三酯有效分離；二是需要合適的數(shù)據(jù)處理和結(jié)果表達(dá)方法.針對(duì)多變量的分析，目前采用統(tǒng)計(jì)學(xué)或化學(xué)計(jì)量學(xué)方法較多.

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（配備Elite P230 高壓恒流泵，EC2000 色譜工作站）：大連依利特分析儀器有限公司；JUPITER C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm×5 μm）：美國(guó)菲羅門公司；SEDEX55 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器：法國(guó)SEDERE 公司；隔膜真空泵：天津市騰達(dá)過濾器件廠.

石油醚（沸程：第Ⅰ類30～60 ℃）：開封化學(xué)試劑總廠；甲醇：洛陽(yáng)化學(xué)試劑廠；丙酮：洛陽(yáng)昊華化學(xué)試劑有限公司；乙腈、二氯甲烷：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，以上試劑均為分析純.

1.2 樣品及制備

收集產(chǎn)地、品種各異的大豆（33 種）、花生（39種）、葵花籽（17 種）、芝麻（37 種）和菜籽（58 種）等油料種子，采用石油醚浸泡提取，然后過濾，蒸餾除去溶劑，在105 ℃下除去水分，取油樣備用.玉米油和棕櫚油樣來源于不同的油脂公司.

1.3 高效液相色譜法的操作條件

高效液相色譜法分離甘油三酯：取油樣用乙腈和二氯甲烷（1∶1）溶解，然后取10 μL 溶液進(jìn)樣.操作條件：流動(dòng)相為乙腈/二氯甲烷，洗脫條件見表1，其中泵A 代表二氯甲烷百分含量，泵B 代表乙腈百分含量.檢測(cè)器條件：溫度為70 ℃，空氣壓縮泵提供載氣，載氣壓力為2.6 Bar.

表1 高效液相色譜法洗脫條件

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

為便于計(jì)算，不考慮不同甘三酯響應(yīng)因子的差異，對(duì)所得色譜圖中的所有甘油三酯色譜峰進(jìn)行面積歸一化，得到各個(gè)組分的相對(duì)含量.按照色譜峰的保留時(shí)間，手動(dòng)輔助定性歸類.在7 種植物油脂的甘油三酯進(jìn)行歸類統(tǒng)計(jì)的基礎(chǔ)上進(jìn)行識(shí)別分析.

聚類-主成分分析（CLU-PCA）：用NIRCal-5.2軟件中的CLU-PCA 處理程序處理數(shù)據(jù).所有樣品利用該軟件的處理向?qū)?，自?dòng)挑選適合的數(shù)據(jù)預(yù)處理方法，不同類的油脂樣品每種都隨機(jī)取2/3 數(shù)量作定標(biāo)集，建立聚類-主成分識(shí)別模型，剩余1/3作驗(yàn)證集，驗(yàn)證建立的判別模型是否合理有效.

2 結(jié)果與分析

2.1 7 種油脂甘油三酯的測(cè)定結(jié)果

按照1.3 方法獲得每一種油脂的高效液相色譜圖，分別取24 ℃棕櫚油25 號(hào)（ZL25）、大豆油（DD095 非轉(zhuǎn)基因）、葵花籽油（KHZ014）、花生油（HS071）、芝麻油（ZM047）、玉米油（YM8）、菜籽油（AH060）、菜籽油（AH075）的高效液相色譜圖作為每一類油脂的代表性色譜圖，如圖1 所示.除菜籽油外，每一類油脂分離的組分?jǐn)?shù)基本一致，但各個(gè)組分的相對(duì)含量有波動(dòng)，而且各種油脂甘油三酯組成上明顯存在差異.依據(jù)保留時(shí)間，共分離出色譜峰38 個(gè)，各種植物油脂甘油三酯組成及含量見表2.

圖1 7 種植物油脂甘油三酯HPLC 分離色譜圖

表2 5 種植物油脂甘油三酯組成及含量 %

由表2 可知，不同的油脂甘三酯組成特征性很強(qiáng)，2、6、7 號(hào)峰是大豆油的主要特征峰，除棕櫚油之外，其他油脂的6、7 號(hào)峰含量都為0；5 號(hào)峰保留時(shí)間短，依據(jù)反相高效液相色譜保留行為，極性較大者保留時(shí)間短，說明此組分極性較大，參照棕櫚油和花生油的甘三酯組成，推測(cè)可能是三亞油酸甘三酯[13]，5 號(hào)峰在大豆油、葵花籽油、玉米油和芝麻油中含量相對(duì)高；8 號(hào)峰除了棕櫚油和高芥酸菜籽油外，其他油脂含量較高；10 號(hào)峰在大豆油、葵花籽油、花生油、玉米油和芝麻油中有較多含量，除花生油外均比5 號(hào)峰和10 號(hào)峰含量低；13號(hào)峰除了菜籽油外，均存在一定含量，15 號(hào)峰次之；大豆油、葵花油和芝麻油的16 號(hào)峰含量為0，棕櫚油的含量略大于1%，花生油的含量小于1%；18 號(hào)峰和20 號(hào)峰是棕櫚油最高含量的甘三酯，而其他油脂偏少，芝麻油的19 號(hào)峰和20 號(hào)峰組分含量有一定特征性；棕櫚油中的23 和24 號(hào)峰也是含量較高組分；21、22 號(hào)峰是花生油的主要特征峰，含量為0.3%～1.4%，而其他4 種油的含量為0；23、24 號(hào)峰是棕櫚油的主要特征峰，含量在1%～11%之間，其他4 種油脂的含量小于1%.菜籽油的譜圖較復(fù)雜，其原因是菜籽油有高低芥酸之分，但譜圖中的色譜峰也有一定的特征性.

2.2 7 種植物油脂的CLU-PCA 分析結(jié)果

將7 種植物油脂38 個(gè)甘油三酯組成，在統(tǒng)一變量后，進(jìn)行識(shí)別模型的探索.使用NIRCal 軟件，在對(duì)各種植物油脂甘油三酯的百分含量的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)og 和ncl（Normalization by Closure）處理后，使用CLU-PCA 方法，使用軟件的數(shù)據(jù)處理向?qū)?，自?dòng)篩選優(yōu)化識(shí)別模型，如圖2 所示，7 種植物油被正確識(shí)別為7 類，識(shí)別模型的準(zhǔn)確率和驗(yàn)證準(zhǔn)確率均為100%.將玉米油和低芥酸菜籽油數(shù)據(jù)代入模型后，發(fā)現(xiàn)玉米油和菜籽油也能被識(shí)別出來，但識(shí)別準(zhǔn)確率分別為90%和92%.分析菜籽油脂肪酸組成（見表3），其芥酸含量差異大，由圖1可知，甘三酯組成差異大，因此，菜籽油高低芥酸含量的差異，導(dǎo)致識(shí)別率略低，針對(duì)菜籽油，數(shù)據(jù)處理方法需要改變.玉米油識(shí)別準(zhǔn)確率偏低，還有待于來源信息更強(qiáng)的玉米油進(jìn)一步研究.

圖2 7 種植物油脂的CLU-PCA 二維識(shí)別模型

表3 7 種植物油脂5 種主要脂肪酸含量 %

從圖2 可知，由于玉米油和芝麻油和葵花籽油信息的特征向量之間的相似性，歐氏距離較近，空間數(shù)據(jù)之間有重疊.數(shù)據(jù)處理中刪去玉米油數(shù)據(jù)后，剩余的6 種植物油脂的CLU-PCA 三維識(shí)別模型如圖3 所示.三維圖顯示，6 種油脂各自聚類效果明顯.

圖3 6 種植物油脂的CLU-PCA 三維識(shí)別模型

3 結(jié)論

以O(shè)DS 為分離柱，乙腈和二氯甲烷為流動(dòng)相，作梯度洗脫，測(cè)定植物油脂的甘油三酯相對(duì)含量，雖然采用的ODS 柱不能完全將所有的甘三酯分離開，但可以分出38 簇峰，而且色譜圖顯示了不同油脂的特征性.以甘三酯含量為變量，采用聚類-主成分分析方法建立7 種植物油脂的識(shí)別模型，結(jié)果顯示，可以達(dá)到識(shí)別油脂的目的.此方法比以脂肪酸為變量的識(shí)別模型更有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)楦嗜サ恼{(diào)和比脂肪酸的調(diào)和難度大，識(shí)別結(jié)果更可靠.

［1］Kumar M，Yadav R A.Experimental IR and Raman spectra and quantum chemical studies of molecular structures，conformers and vibrational characteristics of nicotinic acid and its Noxide［J］.Spectrochimica Acta Part A，2011，79:1316-1325.

［2］Jeffrey R S，Patricia A Z，James A H，et al.Location of high and low affinity fatty acid binding sites on human serum albumin revealed by NMR drug -competition analysis［J］.Journal of Molecular Biology，2006，361:336-351.

［3］Casalea M，Oliveri P，Casolino C，et al.Characterisation of PDO olive oil Chianti Classico by non-selective（UV visible，NIR and MIR spectroscopy）and selective（fatty acid composition）analytical techniques［J］.Analytica Chimica Acta，2012，712:56-63.

［4］陸婉珍.現(xiàn)代近紅外光譜分析技術(shù)［M］.北京：中國(guó)石化出版社，2007:76-78.

［5］Cotte M，Dumas P，Besnard M，et al.Synchrotron FTIR microscopic study of chemical enhancers in transdermal drug delivery:example of fatty acids［J］.Journal of Controlled Release，2004，97:269-281.

［6］范璐，吳娜娜，霍權(quán)恭，等.氣相色譜分析和傅里葉變換紅外吸收光譜識(shí)別花生油中棕櫚油［J］.河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2008，29:12-15.

［7］Vicente J P，Gimeno Adelantado J V，Castro R M，et al.Identification of lipid binders in old oil paintings by separation of 4-bromomethyl-7 -methoxycoumarin derivatives of fatty acids by liquid chromatography with fluorescence detection［J］.Journal of Chromatography A，2005，1076:44-50.

［8］Poulli K I，Mousdis G A，Georgiou C A.Rapid synchronous fluorescence method for virgin olive oil adulteration assessment［J］.Food Chemistry，2007，105:369-375.

［9］王艷，范璐，霍權(quán)恭，等.用三維熒光光譜法測(cè)定8 種植物油脂的熒光信息［J］.河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2010，31:36-39.

［10］Dugo P，Cacciola F，Kumm T.Comprehensive multidimensional liquid chromatography:Theory and applications［J］.Journal of Chromatography A，2008，1184:353-368.

［11］Vinod V T P，Sashidhar R B，Sarma V U M，et al.Comparative amino acid and fatty acid compositions of edible gums kondagogu（Cochlospermum gossypium）and karaya（Sterculia urens）［J］.Food Chemistry，2010，123:57-62.

［12］Kangani C O，Kelley D E，DeLany J P.New method for GC/FID and GC C-IRMS analysis of plasma free fatty acid concentration and isotopic enrichment［J］.Journal of Chromatography B，2008，873:95-101.

［13］安廣杰，候冰冰，王瑛瑤，等.超高效液相色譜法測(cè)定油脂中甘三酯組成［J］.中國(guó)油脂，2011，36:55-58.