李 超，陳曉瓏，李 瑩，張曉峰，李文杰

（鄭州大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，河南 鄭州 450001）

0 引言

沙門氏菌（Salmonella）是主要的食源性致病菌之一，其引起的食物中毒病例位居首位[1].目前的檢測(cè)方法由傳統(tǒng)檢測(cè)法發(fā)展到免疫組學(xué)、分子生物學(xué)和電化學(xué)等方法[2]，但因上述方法操作繁瑣且檢驗(yàn)成本高，難于推廣來滿足食品生產(chǎn)銷售過程中沙門氏菌的快速檢測(cè)，因此快速顯色培養(yǎng)基檢測(cè)成為近年來的研究熱點(diǎn).其原理是利用微生物特異性酶的特點(diǎn)，通過對(duì)應(yīng)的酶顯色底物對(duì)目標(biāo)微生物進(jìn)行篩選鑒定[3].酶顯色底物是由特異性酶識(shí)別基團(tuán)以及相應(yīng)的顯色基團(tuán)兩部分組成，顯色基團(tuán)的主要成分是苯酚衍生物[4].本研究選擇5溴-6 氯-3 吲哚-β-D 半乳糖苷（M-gal）作為沙門氏菌的顯色底物[5]，以普通營養(yǎng)培養(yǎng)基為底板，通過正交優(yōu)化試驗(yàn)，確定沙門氏菌快速檢測(cè)顯色培養(yǎng)基（Rapid detection of Salmonella Chromogenic Medium，RSCM）配方.對(duì)照沙門氏菌國標(biāo)檢測(cè)法，分析RSCM 的出菌率、特異性和檢出時(shí)間，綜合評(píng)價(jià)RSCM 的檢測(cè)性能，以期研制出一種應(yīng)用于生產(chǎn)與銷售等日常檢測(cè)環(huán)節(jié)，易操作，檢測(cè)結(jié)果迅速、準(zhǔn)確，同時(shí)還具有較好的普及推廣性的沙門氏菌快速檢測(cè)培養(yǎng)基，為快速檢測(cè)食品中沙門氏菌提供一定的科學(xué)理論基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 菌株

以傷寒沙門氏菌（CMCC（B）50071）為試驗(yàn)菌株；以鮑氏志賀菌（CMCC（B）51336）、志賀菌I 型（CMCC（B）51105）、志賀菌II 型（CMCC（B）51582）、宋內(nèi)志賀菌（CMCC（B）51592）、福氏志賀菌（CMCC（B）51573）、大腸桿菌（CMCC（B）44103）和大腸桿菌（ATCC25922）為對(duì)照菌株.以上菌株均由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院鑒定保存.

1.2 主要試劑和儀器

蛋白胨粉、酵母膏粉和L-胱氨酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；月桂基硫酸鈉、5-溴-6-氯-3-吲哚-β-D 半乳糖苷：美國Genview 公司；亞硫酸鉍（BS）瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽（XLD）瓊脂、四硫磺酸鈉煌綠增菌液（TTB）和亞硒酸鹽胱氨酸增菌液（SC）：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀和無水碳酸鈉：天津市凱通化工技術(shù)有限公司.

HVE-50 高壓滅菌鍋：日本HIRAYAMA 公司；AL204 電子分析天平：梅特勒托利儀器上海有限公司；GNP-9080 隔水式恒溫培養(yǎng)箱和S-25 精密pH計(jì)：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ 超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司.

1.3 RSCM 的制備

1.3.1 RSCM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方的正交優(yōu)化

RSCM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方包括蛋白胨、酵母膏粉、氯化鈉、月桂基硫酸鈉、碳酸鈉和L-胱氨酸[6].參照單因素試驗(yàn)結(jié)果，以其用量為因素，加入誤差項(xiàng)后應(yīng)用MINITAB15.1 進(jìn)行7 因素3 水平正交試驗(yàn)[7]，平行測(cè)定3 次，因素及水平見表1.

表1 因素與水平 g·L-1

1.3.2 RSCM 顯色底物的劑量確定

以表1 篩選出的配方為基礎(chǔ)，分別添加不同濃度的顯色底物M-gal 并以傷寒沙門氏菌為對(duì)象進(jìn)行單因素分析確定最佳劑量.

1.3.3 RSCM 的制備

使用分析天平準(zhǔn)確稱取各配方，加入去離子水，加熱煮沸至溶解，冷卻至60 ℃左右時(shí)注入無菌塑料平板內(nèi)，徹底冷卻凝固后形成RSCM.

1.4 RSCM 出菌率的測(cè)定

將活化后的傷寒沙門氏菌用無菌生理鹽水進(jìn)行10 倍梯度稀釋，吸取各梯度菌液0.l mL 分別涂布于營養(yǎng)瓊脂、RSCM 和國標(biāo)BS、XLD 培養(yǎng)基平板上，每個(gè)平板重復(fù)3 次.于（36±1）℃分離培養(yǎng)18～24 h 后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)并分別計(jì)算上述3 個(gè)培養(yǎng)基的出菌率[8]，使用F 檢驗(yàn)對(duì)出菌率結(jié)果進(jìn)行分析.

1.5 RSCM 特異性的測(cè)定

用營養(yǎng)肉湯分別將傷寒沙門氏菌和7 種對(duì)照菌株于37 ℃培養(yǎng)24 h，然后分別接種在RSCM上，于（36±1）℃培養(yǎng)12～24 h 后觀察各菌株在RSCM 上的生長狀況.同時(shí)，以國標(biāo)方法做特異性檢驗(yàn)，以參照比對(duì).

1.6 RSCM 檢出時(shí)間的測(cè)定

分別將傷寒沙門氏菌和由試驗(yàn)菌株和7 種對(duì)照菌株形成的混合菌株涂布于RSCM、XLD 和BS培養(yǎng)基平板上，分別于6、12、18、24 和48 h 對(duì)3 個(gè)平板上的沙門氏菌進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，確定檢出時(shí)間.

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用MINITAB15.1 對(duì)正交試驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)與分析，采用SPSS12.0 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，統(tǒng)計(jì)量采用F 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05.

2 結(jié)果與分析

2.1 RSCM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基試驗(yàn)

2.1.1 RSCM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分正交試驗(yàn)

基礎(chǔ)培養(yǎng)基中各因素對(duì)菌落數(shù)的影響見表2.由表2 可知，6 種成分對(duì)菌落數(shù)的影響順序?yàn)椋涸鹿鸹蛩徕c＞酵母膏粉＞蛋白胨＞碳酸鈉＞L-胱氨酸＞氯化鈉.最優(yōu)方案為D2B2A2E2F3C2，即月桂基硫酸鈉0.2 g/L，酵母膏粉3 g/L，蛋白胨25 g/L，碳酸鈉0.02 g/L，L-胱氨酸0.04 g/L，氯化鈉5 g/L.

表2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中各因素對(duì)菌落數(shù)的影響

2.1.2 RSCM 顯色底物劑量的確定（表3）

由表3 可見，M-gal 各濃度間的菌落計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.169，P＞0.05）.但M-gal 濃度的改變對(duì)沙門氏菌的顯色狀況影響較大，并且隨著時(shí)間的延長，顯色效果穩(wěn)定.當(dāng)M-gal 濃度不低于0.60 g/L 時(shí)，RSCM 的顯色效果較佳.從經(jīng)濟(jì)成本方面考慮，將RSCM 中的顯色底物最終濃度設(shè)定為0.60 g/L.

表3 M-gal 濃度對(duì)菌落數(shù)的影響（lgCFU） （±s）

表3 M-gal 濃度對(duì)菌落數(shù)的影響（lgCFU） （±s）

注：各組間菌落計(jì)數(shù)對(duì)比，P>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2.2 RSCM 的出菌率（表4）

由表4 可見，沙門氏菌在RSCM 以及國標(biāo)方法中的XLD 和BS 培養(yǎng)基平板中的出菌率分別為90.7%、89.1%和87.6%.經(jīng)F 檢驗(yàn)，沙門氏菌在以上3 個(gè)平板上的菌落數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.757，P＞0.05）.

表4 沙門氏菌在不同培養(yǎng)基上的出菌率

2.3 RSCM 的特異性（表5）

由表5 可看出，對(duì)照菌株在RSCM 上不顯色或無菌落出現(xiàn)，傷寒沙門氏菌在RSCM 和XLD、BS 培養(yǎng)基平板中的結(jié)果完全一致.

表5 RSCM 特異性檢測(cè)結(jié)果

2.4 RSCM 的檢出時(shí)間

分別觀察傷寒沙門氏菌和混合菌株在RSCM、XLD 和BS 培養(yǎng)基平板上分別培養(yǎng)6、12、18、24、48 h 的生長狀況，結(jié)果如表6 所示.RSCM 在12 h檢測(cè)出的菌落數(shù)與XLD 培養(yǎng)基平板24 h 檢測(cè)出的菌落數(shù)和BS 培養(yǎng)基平板48 h 檢測(cè)出的菌落數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.707，P＞0.05；F=0.981，P＞0.05）.

表6 RSCM 與國標(biāo)法培養(yǎng)基平板不同時(shí)間對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)結(jié)果 （±s）

表6 RSCM 與國標(biāo)法培養(yǎng)基平板不同時(shí)間對(duì)沙門氏菌的檢測(cè)結(jié)果 （±s）

3 結(jié)論

利用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基作為底板，添加6 種基礎(chǔ)配方，并采用一種全新的酶顯色底物M-gal，制備了RSCM 來檢測(cè)沙門氏菌.該方法沿用顯色培養(yǎng)基的原理，制作過程簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便.其中，Mgal 對(duì)于沙門氏菌的生長無任何作用，但其濃度對(duì)顯色效果有很大影響.由于添加了M-gal，RSCM可根據(jù)菌落顏色鑒別沙門氏菌，結(jié)果易于觀察，在（36±1）℃培養(yǎng)12 h 即可顯色，且效果穩(wěn)定.此外，通過對(duì)比RSCM 與國標(biāo)法的出菌率、特異性和檢出時(shí)間，發(fā)現(xiàn)RSCM 的各成分和濃度完全符合沙門氏菌生長的需要，能夠提供充足的養(yǎng)分，并且檢測(cè)結(jié)果可靠.因此，RSCM 在檢測(cè)沙門氏菌方面具有良好性能，特別在檢測(cè)時(shí)間方面具有很大優(yōu)勢(shì)，可滿足快速檢測(cè)的要求，可向衛(wèi)生檢驗(yàn)檢疫部門、食品生產(chǎn)廠家以及各大銷售廠商進(jìn)行普及推廣.

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