張連峰，魏 爭，韓利坤，張緒文，喬海泉

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院普通外科,哈爾濱 150001)

胃癌是一種常見的消化道腫瘤，全球發(fā)病率居惡性腫瘤的第五位，病死率居惡性腫瘤的第三位[1]。在發(fā)展中國家，胃癌的5年生存率<20%，意味著>80%的胃癌患者存在復(fù)發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移的可能[1]。近年來，基因靶向治療已經(jīng)逐步成為新的腫瘤診斷和治療手段，并且取得初步成果[2]。S期激酶相關(guān)蛋白2(Sphase kinaseassociated protein 2,Skp2)在大量實體腫瘤中呈高表達，現(xiàn)已證實其具有癌基因的潛能并與惡性腫瘤的分化程度及預(yù)后密切相關(guān)[3]。本研究使用RNAi沉默Skp2，觀察其對胃癌細胞株SGC7901侵襲能力的影響，為胃癌的基因靶向治療提供新的策略和途徑。

1 材料與方法

1.1材料 SGC7901胃癌細胞株購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實驗中心，質(zhì)粒由日本廣島大學(xué)Yasusei Kudo教授惠贈，Skp2羊抗人抗體、p21小鼠抗人抗體、p27小鼠抗人抗體、Kazal基序逆向誘導(dǎo)半胱氨酸豐富蛋白(reversion-inducing cysteine rich protein with Kazal motif，RECK)小鼠抗人抗體、Sp1小鼠抗人抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶小鼠抗人抗體購自美國Santa Cruz生物技術(shù)公司，質(zhì)粒小提試劑盒購自美國Romega公司。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自碧云天科技公司。化學(xué)發(fā)光顯色液購自美國Millipore公司。

1.2方法

1.2.1胃癌細胞培養(yǎng) 將胃癌細胞株SGC7901接種于含10%胎牛血清、鏈霉素100 μg/mL、青霉素100 U/mL、NaHCO31 g和谷胺酰胺0.3 g的RPMI1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2孵箱(日本SANYO公司 型號MCO-15AC)中培養(yǎng)；取對數(shù)生長期細胞進行傳代和處理。

1.2.2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的獲取 pSuNeo-Skp2表達質(zhì)粒由日本廣島大學(xué)Yasusei Kudo教授贈予，正義鏈為：5′-tcgaGGGAGUGACAAAGACUUUGgaguacugCAAAGUC

UUUGUCACUCCCUUUUU-3′；反義鏈：5′-ctagAAAAAGGGAGUGACAAAGACUUUGcaguacucCAAAGUCUUUGUCACUCCC-3′；設(shè)計序列對應(yīng)114-133位核苷酸(GenBank NM_005983.2)。陰性無功能序列包含與上述陽性質(zhì)粒相同的核苷酸，但為亂碼序列，且與其他種屬無同源性。常規(guī)方法提取純化質(zhì)粒，用紫外分光光度計(上海第三分析儀器廠，型號：UV-754)測定質(zhì)粒濃度。細胞培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板內(nèi)，每孔6.0×105個細胞，然后參照LipofectaminTM2000 Regent(Invitrigen)說明書進行操作轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染48 h后，用0.25%胰酶消化轉(zhuǎn)染的細胞并用培養(yǎng)液重懸細胞，以2000個/mL密度接種至24孔板內(nèi)。細胞貼壁后加入G-418，濃度分別為100～1000 μg/mL，設(shè)置每100 μg/mL為濃度的梯度；細胞培養(yǎng)2周后確定篩選濃度為300 μg/mL，維持濃度為150 μg/mL培養(yǎng)細胞并獲得陽性克隆株。設(shè)立陰性質(zhì)粒為對照組、攜帶目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組為實驗組。

1.2.3侵襲實驗 按試劑說明配制Matrgel膠并加入到Transwell小室內(nèi)，干燥1 h；取對照組和實驗組SGC7901細胞，胰酶消化離心后重懸于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，調(diào)整濃度為5.0×104/mL細胞取200 μL加入至上室，并在下室中加入1500 μL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液；將24 孔板置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。取出Transwell小室，棉簽擦掉上室內(nèi)Matrgel膠及上室內(nèi)底部細胞。4%甲醛固定聚碳酸酯膜下層細胞，然后行Giemsa染色，200倍高倍鏡(日本 OLYMPUS公司，型號：SZ)下任取5個獨立視野觀察并計算穿膜細胞數(shù)目。

1.2.4明膠酶譜法檢測MMP-2、MMP-9活性 每組取相同數(shù)目的細胞在無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h；次日收集上清液，將上清液移入離心管中離心10 min(2000 r/min)(德國Heraeus公司高速低溫離心機，型號：Biofuge Primo R)；與4×上樣緩沖液按照1∶4混合；配制分離膠和濃縮膠,4 ℃進行SDS-PAGE電泳100 V恒壓跑至分離膠和濃縮膠交界處改為90 mA恒流；電泳結(jié)束后,將凝膠置于洗脫液中振蕩洗脫2次,每次30 min,然后用漂洗液漂洗2次,每次20 min，接著將凝膠置于孵育液中37 ℃孵育過夜；孵育結(jié)束后經(jīng)染色液(0.1% Coomassic亮藍、30%甲醇、10%乙酸)染色1 h,及脫色液(甲醇濃度分別為30%、20%、10%,乙酸濃度分別為10 %、10 %、5%)分別脫色30 min、1 h、2 h后，顯示出pro-MMP-2(66×103)和active-MMP-9(92×103)為位于藍色背景上的透亮帶。

1.2.5Western-Blot檢測p27、p21、Sp1、RECK蛋白表達 常規(guī)培養(yǎng)對照組和實驗組SGC7901細胞,取對數(shù)生長期細胞,加入裂解液,提取總蛋白，用二喹啉甲酸測定蛋白濃度；同等體積的蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜；5%脫脂牛奶封閉、洗膜后將膜放置于一抗(1∶250)中室溫孵育3 h,用緩沖液(1×Tris-buffered saline中加入0.1% 吐溫20，pH 7.2～7.4)洗膜3次，每次5 min；然后將膜置于二抗(1∶500)中室溫孵育3 h，TBST洗膜3次，每次5 min；化學(xué)發(fā)光法顯色,用凝膠光密度分析軟件分析陽性條帶,測其積分光密度值。每組實驗重復(fù)3次，用內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶標(biāo)準(zhǔn)化后計算相應(yīng)蛋白變化。

2 結(jié) 果

2.1Skp2-shRNA沉默Skp2表達后胃癌細胞SGC7901侵襲能力的變化 侵襲實驗顯示：實驗組腫瘤細胞侵襲能力顯著低于對照組[(38.1±4.3)個 vs (67.3±7.4)個](P<0.05)(圖1)。

2.2沉默Skp2后胃癌細胞SGC7901 MMP-2和MMP-的活性變化 明膠酶實驗顯示：與對照組相比，實驗組pro-MMP-2、Active-MMP-9活性下降(圖2)。

2.3Skp2-shRNA沉默Skp2表達后各個蛋白的表達 Western Blotting結(jié)果顯示：沉默Skp2后，實驗組與對照組相比，Skp2顯著減少[(86.4±5.9)% vs (21.7±3.1)%](P<0.001)，p27[(47.2±6.1)% vs (92.5±7.8)%]和RECK[(43.2±5.3)% vs (78.8±7.9)%]表達顯著增加(P<0.01)，p21增加[(53.3±3.6)% vs (81.4±8.2)%](P<0.05)，Sp1減少[(77.2±9.7)% vs (41.5±8.6)%](P<0.01)(圖3)。

*與對照組相比，P<0.05

圖3 Skp2-shRNA沉默Skp2表達后胃癌細胞SGC7901各個蛋白表達變化 3A：兩組胃癌細胞SGC7901各個蛋白表達變化； 3B：兩組胃癌細胞SGC7901各個蛋白表達的比較；與對照組相比，#P<0.001，++ P<0.01，+P<0.05，** P<0.01

3 討 論

細胞周期中的正性和負(fù)性調(diào)控因子共同維系、嚴(yán)密調(diào)控細胞周期，Skp2的本質(zhì)是泛素蛋白酶體途徑中E3酶F-box蛋白，通過特異性識別p27、p21并介導(dǎo)其泛素化降解。在對多種惡性腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)Skp2均呈過表達，相應(yīng)地p27、p21則是低表達，且兩者呈負(fù)相關(guān)，p27、p21是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑家族中的一員，在人體多種惡性腫瘤細胞增殖和分化的調(diào)控中起著非常重要的作用[4]，上調(diào)p27、p21蛋白可以抑制腫瘤細胞的增殖和誘導(dǎo)細胞周期G1/S期阻滯[5]。MMP-2、MMP-9能夠降解細胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原,為腫瘤細胞的侵襲提供條件[6]，RECK是MMPs的抑制劑,通過封閉MMPs活性抑制惡性腫瘤侵襲，增強RECK表達使MMPs表達下調(diào)并抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移[7]。Sp1被認(rèn)為是一種轉(zhuǎn)錄水平的活化基因[8],且Sp1為RECK上游調(diào)節(jié)因子，能夠在基因水平對RECK進行負(fù)向調(diào)控[9]。另有實驗證明，Skp2過度表達可促進MMPs表達上調(diào)，增強其活性，進而促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移[10]。因此，本研究在SGC7901細胞中采用RNAi技術(shù)沉默Skp2表達后，觀察能否下調(diào)Sp1，增強RECK蛋白表達，降低胃癌細胞在體外的侵襲能力，并揭示其相關(guān)機制。

侵襲實驗顯示：沉默Skp2表達后，實驗組侵襲細胞數(shù)減少。為進一步揭示其機制，分別通過明膠酶譜法和蛋白印跡實驗檢測MMPs的活性及p27、p21、Sp1、RECK蛋白的表達。明膠酶實驗顯示：金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9活性較對照組顯著下降；蛋白印跡實驗顯示：實驗組較對照組p27、p21和RECK表達上調(diào)，Sp1表達下調(diào)，說明在胃癌細胞SGC7901中，過表達的Skp2可能是通過增強Sp1蛋白表達進而增強腫瘤細胞的侵襲能力，沉默Skp2蛋白表達后，Sp1蛋白表達下調(diào)，抑制胃癌細胞侵襲能力。而Sp1蛋白的表達下調(diào)是由沉默Skp2直接導(dǎo)致，還是沉默Skp2后p27、p21蛋白的表達上調(diào)所致還需進一步研究。

綜上所述，在胃癌細胞株SGC7901的實驗研究中Skp2-shRNA可作為一種抑制Skp2表達的有效工具，通過下調(diào)Sp1蛋白表達，增強RECK蛋白表達，進而產(chǎn)生抗侵襲效應(yīng)，這為胃癌轉(zhuǎn)移的基因靶向治療提供了新的策略和途徑。

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