張連峰，魏 爭，韓利坤，張緒文，喬海泉

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院普通外科,哈爾濱 150001)

胃癌是一種常見的消化道腫瘤，全球發(fā)病率居惡性腫瘤的第五位，病死率居惡性腫瘤的第三位[1]。在發(fā)展中國家，胃癌的5年生存率<20%，意味著>80%的胃癌患者存在復發(fā)或遠處轉移的可能[1]。近年來，基因靶向治療已經(jīng)逐步成為新的腫瘤診斷和治療手段，并且取得初步成果[2]。S期激酶相關蛋白2(Sphase kinaseassociated protein 2,Skp2)在大量實體腫瘤中呈高表達，現(xiàn)已證實其具有癌基因的潛能并與惡性腫瘤的分化程度及預后密切相關[3]。本研究使用RNAi沉默Skp2，觀察其對胃癌細胞株SGC7901侵襲能力的影響，為胃癌的基因靶向治療提供新的策略和途徑。

1 材料與方法

1.1材料 SGC7901胃癌細胞株購自哈爾濱醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院實驗中心，質粒由日本廣島大學Yasusei Kudo教授惠贈，Skp2羊抗人抗體、p21小鼠抗人抗體、p27小鼠抗人抗體、Kazal基序逆向誘導半胱氨酸豐富蛋白(reversion-inducing cysteine rich protein with Kazal motif，RECK)小鼠抗人抗體、Sp1小鼠抗人抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶小鼠抗人抗體購自美國Santa Cruz生物技術公司，質粒小提試劑盒購自美國Romega公司。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自碧云天科技公司?；瘜W發(fā)光顯色液購自美國Millipore公司。

1.2方法

1.2.1胃癌細胞培養(yǎng) 將胃癌細胞株SGC7901接種于含10%胎牛血清、鏈霉素100 μg/mL、青霉素100 U/mL、NaHCO31 g和谷胺酰胺0.3 g的RPMI1640培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2孵箱(日本SANYO公司 型號MCO-15AC)中培養(yǎng)；取對數(shù)生長期細胞進行傳代和處理。

1.2.2穩(wěn)定轉染細胞株的獲取 pSuNeo-Skp2表達質粒由日本廣島大學Yasusei Kudo教授贈予，正義鏈為：5′-tcgaGGGAGUGACAAAGACUUUGgaguacugCAAAGUC

UUUGUCACUCCCUUUUU-3′；反義鏈：5′-ctagAAAAAGGGAGUGACAAAGACUUUGcaguacucCAAAGUCUUUGUCACUCCC-3′；設計序列對應114-133位核苷酸(GenBank NM_005983.2)。陰性無功能序列包含與上述陽性質粒相同的核苷酸，但為亂碼序列，且與其他種屬無同源性。常規(guī)方法提取純化質粒，用紫外分光光度計(上海第三分析儀器廠，型號：UV-754)測定質粒濃度。細胞培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞接種于6孔板內(nèi)，每孔6.0×105個細胞，然后參照LipofectaminTM2000 Regent(Invitrigen)說明書進行操作轉染；轉染48 h后，用0.25%胰酶消化轉染的細胞并用培養(yǎng)液重懸細胞，以2000個/mL密度接種至24孔板內(nèi)。細胞貼壁后加入G-418，濃度分別為100～1000 μg/mL，設置每100 μg/mL為濃度的梯度；細胞培養(yǎng)2周后確定篩選濃度為300 μg/mL，維持濃度為150 μg/mL培養(yǎng)細胞并獲得陽性克隆株。設立陰性質粒為對照組、攜帶目的基因質粒轉染組為實驗組。

1.2.3侵襲實驗 按試劑說明配制Matrgel膠并加入到Transwell小室內(nèi)，干燥1 h；取對照組和實驗組SGC7901細胞，胰酶消化離心后重懸于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，調整濃度為5.0×104/mL細胞取200 μL加入至上室，并在下室中加入1500 μL含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液；將24 孔板置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h。取出Transwell小室，棉簽擦掉上室內(nèi)Matrgel膠及上室內(nèi)底部細胞。4%甲醛固定聚碳酸酯膜下層細胞，然后行Giemsa染色，200倍高倍鏡(日本 OLYMPUS公司，型號：SZ)下任取5個獨立視野觀察并計算穿膜細胞數(shù)目。

1.2.4明膠酶譜法檢測MMP-2、MMP-9活性 每組取相同數(shù)目的細胞在無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h；次日收集上清液，將上清液移入離心管中離心10 min(2000 r/min)(德國Heraeus公司高速低溫離心機，型號：Biofuge Primo R)；與4×上樣緩沖液按照1∶4混合；配制分離膠和濃縮膠,4 ℃進行SDS-PAGE電泳100 V恒壓跑至分離膠和濃縮膠交界處改為90 mA恒流；電泳結束后,將凝膠置于洗脫液中振蕩洗脫2次,每次30 min,然后用漂洗液漂洗2次,每次20 min，接著將凝膠置于孵育液中37 ℃孵育過夜；孵育結束后經(jīng)染色液(0.1% Coomassic亮藍、30%甲醇、10%乙酸)染色1 h,及脫色液(甲醇濃度分別為30%、20%、10%,乙酸濃度分別為10 %、10 %、5%)分別脫色30 min、1 h、2 h后，顯示出pro-MMP-2(66×103)和active-MMP-9(92×103)為位于藍色背景上的透亮帶。

1.2.5Western-Blot檢測p27、p21、Sp1、RECK蛋白表達 常規(guī)培養(yǎng)對照組和實驗組SGC7901細胞,取對數(shù)生長期細胞,加入裂解液,提取總蛋白，用二喹啉甲酸測定蛋白濃度；同等體積的蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉移至硝酸纖維膜；5%脫脂牛奶封閉、洗膜后將膜放置于一抗(1∶250)中室溫孵育3 h,用緩沖液(1×Tris-buffered saline中加入0.1% 吐溫20，pH 7.2～7.4)洗膜3次，每次5 min；然后將膜置于二抗(1∶500)中室溫孵育3 h，TBST洗膜3次，每次5 min；化學發(fā)光法顯色,用凝膠光密度分析軟件分析陽性條帶,測其積分光密度值。每組實驗重復3次，用內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶標準化后計算相應蛋白變化。

2 結 果

2.1Skp2-shRNA沉默Skp2表達后胃癌細胞SGC7901侵襲能力的變化 侵襲實驗顯示：實驗組腫瘤細胞侵襲能力顯著低于對照組[(38.1±4.3)個 vs (67.3±7.4)個](P<0.05)(圖1)。

2.2沉默Skp2后胃癌細胞SGC7901 MMP-2和MMP-的活性變化 明膠酶實驗顯示：與對照組相比，實驗組pro-MMP-2、Active-MMP-9活性下降(圖2)。

2.3Skp2-shRNA沉默Skp2表達后各個蛋白的表達 Western Blotting結果顯示：沉默Skp2后，實驗組與對照組相比，Skp2顯著減少[(86.4±5.9)% vs (21.7±3.1)%](P<0.001)，p27[(47.2±6.1)% vs (92.5±7.8)%]和RECK[(43.2±5.3)% vs (78.8±7.9)%]表達顯著增加(P<0.01)，p21增加[(53.3±3.6)% vs (81.4±8.2)%](P<0.05)，Sp1減少[(77.2±9.7)% vs (41.5±8.6)%](P<0.01)(圖3)。

*與對照組相比，P<0.05

圖3 Skp2-shRNA沉默Skp2表達后胃癌細胞SGC7901各個蛋白表達變化 3A：兩組胃癌細胞SGC7901各個蛋白表達變化； 3B：兩組胃癌細胞SGC7901各個蛋白表達的比較；與對照組相比，#P<0.001，++ P<0.01，+P<0.05，** P<0.01

3 討 論

細胞周期中的正性和負性調控因子共同維系、嚴密調控細胞周期，Skp2的本質是泛素蛋白酶體途徑中E3酶F-box蛋白，通過特異性識別p27、p21并介導其泛素化降解。在對多種惡性腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)Skp2均呈過表達，相應地p27、p21則是低表達，且兩者呈負相關，p27、p21是細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑家族中的一員，在人體多種惡性腫瘤細胞增殖和分化的調控中起著非常重要的作用[4]，上調p27、p21蛋白可以抑制腫瘤細胞的增殖和誘導細胞周期G1/S期阻滯[5]。MMP-2、MMP-9能夠降解細胞外基質中的Ⅳ型膠原,為腫瘤細胞的侵襲提供條件[6]，RECK是MMPs的抑制劑,通過封閉MMPs活性抑制惡性腫瘤侵襲，增強RECK表達使MMPs表達下調并抑制腫瘤細胞轉移[7]。Sp1被認為是一種轉錄水平的活化基因[8],且Sp1為RECK上游調節(jié)因子，能夠在基因水平對RECK進行負向調控[9]。另有實驗證明，Skp2過度表達可促進MMPs表達上調，增強其活性，進而促進腫瘤細胞轉移[10]。因此，本研究在SGC7901細胞中采用RNAi技術沉默Skp2表達后，觀察能否下調Sp1，增強RECK蛋白表達，降低胃癌細胞在體外的侵襲能力，并揭示其相關機制。

侵襲實驗顯示：沉默Skp2表達后，實驗組侵襲細胞數(shù)減少。為進一步揭示其機制，分別通過明膠酶譜法和蛋白印跡實驗檢測MMPs的活性及p27、p21、Sp1、RECK蛋白的表達。明膠酶實驗顯示：金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9活性較對照組顯著下降；蛋白印跡實驗顯示：實驗組較對照組p27、p21和RECK表達上調，Sp1表達下調，說明在胃癌細胞SGC7901中，過表達的Skp2可能是通過增強Sp1蛋白表達進而增強腫瘤細胞的侵襲能力，沉默Skp2蛋白表達后，Sp1蛋白表達下調，抑制胃癌細胞侵襲能力。而Sp1蛋白的表達下調是由沉默Skp2直接導致，還是沉默Skp2后p27、p21蛋白的表達上調所致還需進一步研究。

綜上所述，在胃癌細胞株SGC7901的實驗研究中Skp2-shRNA可作為一種抑制Skp2表達的有效工具，通過下調Sp1蛋白表達，增強RECK蛋白表達，進而產(chǎn)生抗侵襲效應，這為胃癌轉移的基因靶向治療提供了新的策略和途徑。

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