曲茂華，張鳳英，何名芳，陳衛(wèi)平

（江西農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，江西南昌330045）

海藻糖是一種非還原性二糖，分子式是C12H22O11·2H2O，廣泛分布于自然界中許多生物細胞中。海藻糖是一種生物應(yīng)激代謝產(chǎn)物，一些在極端環(huán)境生長的古生菌、真菌，以及一些生長在不良環(huán)境中的動植物細胞中海藻糖含量較高。甚至在可以用于清理核污染的抗輻射型細菌如耐輻射球菌（Deinococcus radiodurans）[1]中也發(fā)現(xiàn)了海藻糖的存在。海藻糖在生物細胞中的作用是保護細胞抵抗不良環(huán)境的影響，其功能是保護細胞質(zhì)膜，蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子空間結(jié)構(gòu)和功能活性，維持滲透壓和防止細胞內(nèi)營養(yǎng)成分流失。由于海藻糖具有以上功能，它可用于醫(yī)學生物制品中起到保護劑的作用[2]；增強農(nóng)作物抗逆性[3]，通過轉(zhuǎn)基因手段來培育耐鹽堿型農(nóng)作物[4]，培育抗凍果蔬等；同時，海藻糖不具有還原性，不會發(fā)生美拉德反應(yīng)，可以作為穩(wěn)定的添加劑應(yīng)用于食品工業(yè)。因此，對海藻糖進行研究具有重要意義，本文針對海藻糖生物合成、作用機理、應(yīng)用方面的最新研究進展進行綜述。

1 海藻糖合成的相關(guān)酶以及調(diào)控途徑

1.1 海藻糖合成途徑

目前對海藻糖合成代謝途徑的研究文獻較豐富。研究發(fā)現(xiàn)在生物體內(nèi)的海藻糖合成途徑主要有以下幾條：一是OtsAB途徑，通過TPS（Trehalose-6-phosphate synthase，6-磷酸海藻糖合成酶）和TPP（Trehalose-6-phosphate phosphatase，6-磷酸海藻糖磷酸酯酶）酶來形成海藻糖[5]。在酵母細胞內(nèi)通過TPS1和TPS2酶來合成海藻糖[6]，如釀酒酵母；而其他一些真菌中的海藻糖合成途徑還有一些輔助性的且作用不是很明顯的酶的參與，如TPS3和TSL1[7]。二是TreYZ途徑，是在Arthrobacter sp.中發(fā)現(xiàn)的，通過兩步催化反應(yīng)來合成海藻糖[8]。三是TreS（Trehalose synthase，海藻糖合酶）途徑，該途徑目前只在細菌中被發(fā)現(xiàn)，TreS酶活具有可逆性[9]，在谷氨酸棒狀桿菌中，TreS酶在細胞內(nèi)海藻糖過量情況下會將海藻糖轉(zhuǎn)化為麥芽糖，以調(diào)節(jié)細胞內(nèi)海藻糖濃度平衡[10]。除以上幾種途徑外，還有兩條海藻糖合成途徑，分別為TreT（Trehalose glycosyltransferase，海藻糖糖基轉(zhuǎn)移酶）途徑和TreP（Trehalose phosphorylase，海藻糖磷酸化酶）途徑，這兩條途徑與TreS途徑一樣，具有可逆的催化活性[11]。

Mladen Tzvetkov等[12]對谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）進行研究，但研究重點在于弄清其中三條海藻糖合成途徑的影響大小。研究表明，OtsAB途徑和TreYZ途徑是細胞內(nèi)合成海藻糖的兩條主要途徑，而TreS途徑不是細胞內(nèi)海藻糖的主要合成途徑。通過OtsAB途徑合成1mol的海藻糖需要消耗1mol葡萄糖-6-磷酸以及1mol的UDP-葡萄糖，但通過TreYZ途徑合成1mol海藻糖需要消耗2mol ADP-葡萄糖（用于糖原合成），并且細胞往往會優(yōu)先選擇TreYZ途徑而不是OtsAB途徑來合成海藻糖，而且在C.glutamicum培養(yǎng)基中添加微量的糖類碳源，細胞僅通過TreYZ途徑就可以完全滿足對海藻糖的需要。

1.2 海藻糖合成酶活性位點及調(diào)控途徑

在分子水平對海藻糖合成酶進行研究的難度相對較高，目前在此方面研究進展較為緩慢，最大突破是TreS酶與MTHase（Maltooligosyltrehalose trehalohydrolase，麥芽寡糖基海藻糖水解酶）三維結(jié)構(gòu)測定。

英國科學家以具有產(chǎn)海藻糖能力的結(jié)核桿菌（Mycobacterium tuberculosis）[13]作為研究菌株，對細胞內(nèi)TreS酶進行檢測和分析，詳細闡述了海藻糖合酶作用機制及其三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)TreS酶活可以整合到其他產(chǎn)物的合成途徑中[14]。TreS屬于糖苷水解酶家族（Family GH13）[15]，其結(jié)構(gòu)由兩段保守區(qū)域組成，一個是催化區(qū)域（（β/α）8 barrel-like折疊，也稱TIM barrel折疊），另一個是C-末端β-夾心結(jié)構(gòu)區(qū)域。其中靠近酶活性位點的β3-β4環(huán)狀結(jié)構(gòu)是鈣離子結(jié)合位點，但是其功能尚不明確。β7-β8環(huán)狀結(jié)構(gòu)主要作用是在底物催化過程中固定底物，使底物在整個催化過程中一直固定于酶活性位點上。在催化麥芽糖時，催化反應(yīng)一直在酶的活性位點上進行，其間所形成的葡萄糖單體不會釋放，直到葡萄糖單體重新合成出海藻糖為止。另外，產(chǎn)物也是通過β7-β8環(huán)狀結(jié)構(gòu)固定于酶活性位點上，當產(chǎn)物需要釋放時，β7-β8環(huán)狀結(jié)構(gòu)中所含的兩個保守區(qū)域中的氨基酸發(fā)生替換（Ser（絲氨酸）替換了 Thr（蘇氨酸）；Asp（天冬氨酸）替換了Ser），使得環(huán)狀結(jié)構(gòu)發(fā)生重構(gòu)而失去固定作用，將產(chǎn)物釋放到溶液中并接納新的底物。

MTHase是海藻糖合成途徑中一種重要的a-淀粉酶[16]。該酶與MTSase（Maltooligosyltrehalose synthase，麥芽寡糖基海藻糖合成酶）協(xié)同作用，切割中間產(chǎn)物化合物中的α-1，4糖苷鍵生成海藻糖，該過程對海藻糖的形成起著至關(guān)重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)[17]，Asp252（天冬氨酸）與Glu283（谷氨酸）位于MTHase的催化位點處，在實驗中構(gòu)建突變株：D252S（Ser替換了Asp252）、D252E（Ser替換了Glu283）、E283Q（Gln（谷氨酰胺）替換了Glu283），同野生型菌株比較，它們的酶活性僅為對照組野生菌株酶活性的0.04%、0.03%和0.6%。對突變株與野生型菌株所產(chǎn)生的MTHase進行結(jié)構(gòu)分析以及底物催化實驗，結(jié)果表明，使用Ser或Thr替換Asp252后，在反應(yīng)時在活性位點酶與底物之間會插入一個水分子，這樣會使原先的雙取代機制變?yōu)閱我蝗〈鷻C制，對Glu252進行替換后，反應(yīng)中會形成穩(wěn)定的酶-底物復合物。Asp252與底物所發(fā)生的雙取代反應(yīng)有直接關(guān)系，Glu則控制底物或產(chǎn)物的釋放。

2 海藻糖生產(chǎn)應(yīng)用研究

2.1 海藻糖生產(chǎn)方法

海藻糖生產(chǎn)目的是為了獲得高純度海藻糖產(chǎn)品以及相關(guān)酶產(chǎn)品[18]。目前在實驗室和生產(chǎn)上制備海藻糖主要有三種方法：一是從生物細胞中提取；二是采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)；三是采用微生物發(fā)酵提取相關(guān)海藻糖合成酶，采用酶法合成海藻糖。

發(fā)酵法：由于微生物生長旺、繁殖快，易于培養(yǎng)，采用深層發(fā)酵海藻糖具有先天的優(yōu)越性，利用產(chǎn)海藻糖酵母、細菌等為出發(fā)菌株，選育出產(chǎn)海藻糖高產(chǎn)菌株，發(fā)酵生產(chǎn)海藻糖，再采用有效分離提取的方法提取和精制。

酶合成法：酶合成法是采用微生物發(fā)酵產(chǎn)生并提取相關(guān)海藻糖合成酶類，以各類碳水化合物為底物來合成海藻糖。酶的最大缺點是其脆弱性，容易失活，實際生產(chǎn)中使用相關(guān)合成酶進行海藻糖生產(chǎn)，要考慮保持酶活性和酶類制劑的成本，可使用酶固定化或細胞固定化技術(shù)來保護酶類。目前，海藻糖酶的固定化這方面研究比較少。

2.2 海藻糖相關(guān)菌株篩選與改良

無論采用發(fā)酵法或酶法生產(chǎn)海藻糖，獲得優(yōu)良菌株對海藻糖工業(yè)化生產(chǎn)具有重要價值，如能采用基因工程等技術(shù)獲得可在胞外積累的菌株生產(chǎn)海藻糖，對于提高生產(chǎn)效率有較大意義。

海藻糖合成方面可以使用的菌株非常廣泛，包括酵母、根霉、細菌以及一些藻類都可以生產(chǎn)海藻糖。

在酵母菌方面，一般使用的菌株為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和裂殖酵母（Schizosaccharomycespombe）以及耐寒性酵母（Guehomyces pullulans）等，它們都可以在細胞內(nèi)通過TPS1與TPS2酶催化生產(chǎn)海藻糖[19]，直接用抽提法從酵母菌中獲取海藻糖，但是這種方法效率偏低。Fran?ois J M等[20]重點研究探討了Saccharomyces cerevisiae中與海藻糖合成有關(guān)基因調(diào)控機制，對酵母細胞內(nèi)海藻糖提取工藝進行一定程度的優(yōu)化。

除了用酵母外，海藻糖生產(chǎn)菌株主要集中于桿菌屬和球菌屬等菌株[21]。如谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）、結(jié)核桿菌（Mycobacterium tuberculosis）、惡臭假單孢菌（Pseudomonas putida）、渾濁紅球菌（Rhodococcus opacus）、丙酸桿菌（Propionibacterium freudenreichii）及耐輻射球菌（Deinococcus radiodurans）等菌株，都可以用于生產(chǎn)海藻糖[22]。大腸桿菌在滲透壓脅迫環(huán)境中也可以積累內(nèi)源性海藻糖，大腸桿菌雖然可以生產(chǎn)海藻糖，但需要通過基因改良除去細胞中的海藻糖酶才能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，并且需要進一步考察在海藻糖過量情況下海藻糖對大腸桿菌細胞的不利影響，這也是使用大腸桿菌來生產(chǎn)海藻糖的研究重點[23]。Mary Jackson等研究了Mycobacterium tuberculosis中海藻糖合成代謝機制[24]，并對相關(guān)基因調(diào)控進行總結(jié)，得到有效生產(chǎn)海藻糖的改良型突變株。結(jié)核桿菌雖能有效地在細胞內(nèi)積累海藻糖，但結(jié)核桿菌屬于致病菌，不建議用于海藻糖工業(yè)化生產(chǎn)。

嗜熱菌株中可用于海藻糖生產(chǎn)的菌株有嗜熱棲熱菌（Thermus thermophilus）、紅色亞棲熱菌（Meiothermus ruber）、高溫單胞菌（Thermomonospora curvata）及一些極端嗜熱的古生菌如耐超高溫熱棒菌（Pyrobaculum aerophilum）、硫礦硫化葉菌（Sulfolobus solfataricus）與熱球菌（Pyrococcus horikoshii）等[25]都可以在高溫環(huán)境中積累海藻糖，并在菌種改良后投入工業(yè)化生產(chǎn)，但要考慮發(fā)酵環(huán)境以及相關(guān)設(shè)備耐熱性及能耗等因素。嗜熱菌株中海藻糖合成途徑普遍只有海藻糖合酶途徑。由于海藻糖合酶活性可逆，因此海藻糖產(chǎn)量不很穩(wěn)定。在嗜熱菌篩選過程中，取樣點最好選在溫度極高（最好在45℃以上）的地方，如活火山口，工廠廢熱水排放口等常年高溫的環(huán)境。

另外，嗜極菌如嗜酸菌（Picrophilus torridus）[26]等也可生產(chǎn)海藻糖。

采用基因測序方法來篩選海藻糖合成菌株并通過轉(zhuǎn)基因或基因敲除等手段改良現(xiàn)有生產(chǎn)菌株[27]，可使得海藻糖產(chǎn)量有較大幅度提高。目前在新菌株找尋以及現(xiàn)有生產(chǎn)菌株改良方面，使用基因工程手段對菌株進行直接操作的人工定向基因突變技術(shù)，正代替以往使用的紫外誘變等非定向基因突變育種技術(shù)。而紫外誘變以及化學試劑誘變?nèi)允怯行У木N改良手段[28]，如在谷氨酸棒狀桿菌誘變育種中，選擇IPTG（異丙基硫代半乳糖苷）作為誘變劑，可以有效地培育出海藻糖高產(chǎn)突變株，而NTG（亞硝基胍）對谷氨酸棒狀桿菌幾乎沒有誘導作用[29]。但是紫外誘變和化學誘變方法弊端比較大，比如正突變相對過少，篩選過程繁瑣等。

3 海藻糖對生物細胞保護作用機理

目前，相關(guān)研究主要集中在細胞處于各種不利環(huán)境（如寒冷、干旱、高離子濃度等）中時，海藻糖對細胞的保護機理[30]。當細胞處于寒冷環(huán)境中時，含有海藻糖的細胞耐凍性要高，這是由于海藻糖的存在提高了細胞中溶質(zhì)濃度，有效降低細胞質(zhì)的冰點。在缺水狀態(tài)下，細胞中會積累大量的海藻糖，這些海藻糖可以在細胞脫水狀態(tài)下與脂類物質(zhì)形成化合物（Trehalose dinocardiomycolates）來維持生物膜結(jié)構(gòu)[31]，阻止細胞內(nèi)囊泡溶解，并且降低脂類物質(zhì)發(fā)生變質(zhì)，保持脂類物質(zhì)的正常狀態(tài)和功能[32]。

海藻糖應(yīng)對干燥環(huán)境的機制是形成玻璃化結(jié)構(gòu)[33]。海藻糖會形成一種類似于玻璃態(tài)的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)表面形成海藻糖二水化合物，將水分子牢牢的固定在細胞內(nèi)，從而阻止水分的流失，維持細胞的整體結(jié)構(gòu)。有研究表明，鹽分脅迫對生物細胞有兩方面的影響[34]，一是造成滲透壓差，使細胞內(nèi)水分流失；二是在細胞周圍制造一個高離子強度的環(huán)境。細胞自身的適應(yīng)性調(diào)節(jié)是在細胞質(zhì)中積累大量可溶性溶質(zhì)[35]，這些溶質(zhì)對于緩解細胞所遭受的鹽分脅迫具有兩方面的抵御作用[36]，一是降低細胞內(nèi)外濃度差，二是穩(wěn)定細胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能。

Andreas Wolf等[37]對谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）中海藻糖作用機制以及酶調(diào)控機制進行深入研究與探討，通過對這些突變株的環(huán)境耐受性進行測定與分析，海藻糖可以通過與細胞中的脂質(zhì)形成化合物來保護生物膜，維持谷氨酸棒狀桿菌細胞的穩(wěn)定性。

4 海藻糖的應(yīng)用

4.1 在食品工業(yè)中的應(yīng)用

海藻糖在食品工業(yè)中的應(yīng)用主要體現(xiàn)在兩方面：

4.1.1 作為保護性添加劑使用 由于海藻糖在氫離子較高的條件下能保持相對穩(wěn)定狀態(tài)[38]，在含氨基酸或蛋白質(zhì)的沸水中不會發(fā)生美拉德反應(yīng)特性，可以使食品中營養(yǎng)性風味物質(zhì)保存完好[39]，有效延長食品相關(guān)產(chǎn)品貨架期。將海藻糖添加進淀粉類食品中，可以有效防止在常溫和低溫下淀粉類食品老化現(xiàn)象[40]，改善食品品質(zhì)。另外，海藻糖處于無定形狀態(tài)時極易吸收水分，可以作為食品優(yōu)良的安全干燥劑[41]。

4.1.2 作為食用性糖類開發(fā)新型食品 將海藻糖作為一種高級食用糖來進行工業(yè)化生產(chǎn)[42]，需要考慮相關(guān)成本問題。與幾十年前初期相比，目前海藻糖工業(yè)化產(chǎn)量有較大幅度提升，但如果用作食用糖，其成本依然比普通糖類如蔗糖等要高，并且涉及到菌株改良以及提取工藝等一系列問題，大規(guī)模用作食用糖還需很長的路要走。目前，海藻糖的食用性僅僅體現(xiàn)在食品添加劑層面[43]。

4.2 醫(yī)學領(lǐng)域中的應(yīng)用

生物制劑對環(huán)境的敏感性很高，生物醫(yī)學領(lǐng)域中涉及到的材料多屬于容易失活的生物制劑，如何提高生物制劑對于環(huán)境的抗逆性[44]，降低保存成本并延長保存期，是該領(lǐng)域要研究的關(guān)鍵問題。相關(guān)研究結(jié)果表明，通過添加海藻糖或轉(zhuǎn)基因手段將海藻糖相關(guān)酶類的調(diào)控基因片段導入到細胞內(nèi)，增強相關(guān)生物制劑的環(huán)境抗逆性[45]，并具有顯著效果。Nan Zhang等[46]利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將藻類中與海藻糖合成有關(guān)的基因片段導入到酵母細胞中，研究酵母在高鹽濃度下的細胞存活率與海藻糖的生產(chǎn)率之間的關(guān)系，與對照組相比，導入海藻糖相關(guān)合成基因的細胞能夠在極高滲透壓環(huán)境中生存，而且環(huán)境中鹽濃度越高，細胞內(nèi)海藻糖的濃度也相應(yīng)越高直到達到最大值。

4.3 農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用

海藻糖對于果蔬植物環(huán)境抗逆性的提高也有重要意義。Jin Duan等[47]通過實驗將假單孢菌（Pseudomonas sp.）海藻糖合成酶相關(guān)基因片段導入植物細胞，與對照組相比，在寒冷、重金屬存在、干燥等各種極端環(huán)境中，細胞內(nèi)積累海藻糖的植物抗逆性有明顯改善。此外，根據(jù)Theerakulpisut的最新研究顯示[48]，使用海藻糖溶液處理后的水稻種子，可以在高鹽濃度環(huán)境中生長，能有效減輕NaCl對細胞中葉綠素的損害，同時降低細胞內(nèi)Na+與K+含量的比值，促進水稻發(fā)芽和生長。

將調(diào)控海藻糖合成相關(guān)基因?qū)氲狡渌锓N中，培育出抗逆性強的改良物種[49]。這方面研究應(yīng)用性非常強，主要用于培育抗旱抗寒以及抗鹽堿型農(nóng)作物[50]，使得植物可以適應(yīng)更加惡劣的環(huán)境。

5 結(jié)論

海藻糖是生物細胞抵抗不良環(huán)境的應(yīng)激代謝產(chǎn)物，海藻糖在生物細胞中的作用是保護細胞抵抗不良環(huán)境影響，其功能是保護細胞質(zhì)膜，蛋白質(zhì)、核酸等生物大分維持空間結(jié)構(gòu)和功能活性，維持滲透壓和防止細胞內(nèi)營養(yǎng)成分的流失。

相關(guān)研究表明：海藻糖在生物體內(nèi)的合成，主要有OtsAB途徑、TreYZ途徑、TreS途徑、TreT途徑和TreP途徑，后三條途徑具有可逆的催化活性。對海藻糖代謝調(diào)控機制還不完全清楚，僅停留在對海藻糖合酶（TreS）與麥芽寡糖基海藻糖水解酶（MTHase）三維結(jié)構(gòu)研究。同時，很多研究成果僅局限在初步明確了幾條海藻糖合成途徑，對海藻糖合成途徑中相關(guān)酶類研究仍然不足。

目前在實驗室和生產(chǎn)上制備海藻糖主要有三種方法：一是從生物細胞中提??；二是采用微生物發(fā)酵生產(chǎn)；三是采用微生物發(fā)酵提取相關(guān)海藻糖合成酶，采用酶法合成海藻糖。目前快速發(fā)展的生物技術(shù)促進了對海藻糖的研究。更需要對海藻糖相關(guān)生產(chǎn)菌株進行深入研究，重點在于培育出產(chǎn)量較高的生產(chǎn)菌株以及開發(fā)出相關(guān)生產(chǎn)工藝。對相關(guān)酶類代謝機制以及酶三維結(jié)構(gòu)分析的研究是目前該領(lǐng)域研究熱點，隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)大幅度進步以及更先進分析儀器和相關(guān)配套軟件的出現(xiàn)與應(yīng)用，形成了軟硬件相互結(jié)合并行研究的新局面，在海藻糖基礎(chǔ)領(lǐng)域研究一定能取得新的進展。

海藻糖應(yīng)對干燥環(huán)境的機制是形成玻璃化結(jié)構(gòu)，阻止水分流失，維持細胞整體結(jié)構(gòu)。在高滲環(huán)境中，海藻糖可以有效降低細胞內(nèi)外濃度差，穩(wěn)定細胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能。由于海藻糖是一種非還原性二糖，不會發(fā)生美拉德反應(yīng)，能保護生物細胞和抵抗不良環(huán)境，因此，被廣泛用于食品、化妝品、生物醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。

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