朱利斌，張華，林進(jìn)漢，戴麗娜，黃璜，李仲榮

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 小兒外科，浙江 溫州 325027）

·論 著·

改良NADPH-d和AchE酶組織化學(xué)法診斷先天性巨結(jié)腸

朱利斌，張華，林進(jìn)漢，戴麗娜，黃璜，李仲榮

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 小兒外科，浙江 溫州 325027）

目的：探討進(jìn)一步改良后的還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黃遞酶（NADPH-d）和乙酰膽堿酯酶（AchE）酶組織化學(xué)染色法診斷先天性巨結(jié)腸（HD）的優(yōu)勢(shì)，以期提高HD術(shù)前及術(shù)中診斷的準(zhǔn)確率。方法：取HD患兒術(shù)中切除的結(jié)腸標(biāo)本18例，其中女7 例，男11例，平均年齡（8.6±3）月。標(biāo)本分狹窄段、移行段、擴(kuò)張段，其冰凍切片分別用改良的NADPH-d和AchE酶組織化學(xué)染色法進(jìn)行染色，與常規(guī)HE染色進(jìn)行比較，并用腸神經(jīng)元特異標(biāo)記物β-III Tubulin（TUJ-1）行免疫熒光及蛋白基因產(chǎn)物9.5（protein gene product 9.5，PGP9.5）行免疫組化檢查論證改良方法的特異性。結(jié)果：NADPH-d法能快速確定擴(kuò)張段近端切緣是否存在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，診斷HD的陽(yáng)性率為94.4%（17/18）；AchE法對(duì)于HD狹窄段黏膜下異常增生的神經(jīng)叢診斷陽(yáng)性率為88.9%（16/18）；兩組間診斷陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。耗時(shí)方面NADPH-d法為（7.0±1.7）min，AchE法為（30.9±2.2）min，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。上述兩種改良方法與TUJ-1及PGP9.5對(duì)照結(jié)果一致。結(jié)論：NADPH-d法能快速確定腸管切緣是否有神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分布，適用于術(shù)中快速診斷HD；AchE法適用于術(shù)前直腸黏膜層的活檢診斷。

先天性巨結(jié)腸；診斷；酶組織化學(xué)；結(jié)直腸外科手術(shù)

先天性巨結(jié)腸（Hirschsprung disease，HD）是由腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育遷移異常導(dǎo)致的腸道疾病，病變段結(jié)腸運(yùn)動(dòng)功能障礙，由此患兒出現(xiàn)反復(fù)便秘、腹脹等癥狀，嚴(yán)重影響生存質(zhì)量。該病的治療依賴(lài)于手術(shù)切除病變腸段，目前普遍行I期經(jīng)肛門(mén)拖出巨結(jié)腸根治術(shù)。根據(jù)術(shù)中組織活檢冰凍切片后HE染色來(lái)確定切緣是否存在腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分布，但常規(guī)的HE染色對(duì)腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的有效識(shí)別率不高，乙酰膽堿酯酶（AchE）法也存在反應(yīng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而影響術(shù)中應(yīng)用等問(wèn)題?；诩韧难芯浚覀冞M(jìn)一步改良了還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸黃遞酶（NADPH-d）及AchE兩種酶組織化學(xué)染色法，發(fā)現(xiàn)NADPH-d法有一定優(yōu)勢(shì)，可供術(shù)中快速診斷HD，并確定腸管切除范圍，有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源標(biāo)本均取自于2009年1月-2012年12月本院18例HD患兒巨結(jié)腸根治術(shù)術(shù)中切除的結(jié)腸，患兒男11例，女7例，年齡3～16個(gè)月，平均（8.6±3）月。標(biāo)本分?jǐn)U張段、移形段和狹窄段，腸管橫切面常規(guī)冰凍切片，片厚4μm，多聚賴(lài)氨酸載玻片貼片，制片后分批超低溫冰箱保存。隨機(jī)奇數(shù)切片做NADPH-d法快速染色，偶數(shù)切片做AchE法染色。所用標(biāo)本經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 方法

1.2.1 改良NADPH-d酶組織化學(xué)反應(yīng)：反應(yīng)液由1 mL 0.1 mol/L PB液（pH 8.0）中加入0.5 mg NADPH-d（Sigma）、10μL二甲基亞砜（蘇州正興化工研究院）、0.6 mg NBT（Sigma）、3μL Triton X-100（北京拜爾迪生物公司）組成。反應(yīng)液37 ℃提前預(yù)熱，滴加反應(yīng)液后再置于37 ℃水浴箱中5～10 min，觀察反應(yīng)液由澄黃色變?yōu)槲⒆仙笕〕?，光鏡下觀察神經(jīng)節(jié)細(xì)胞顯示清晰后PBS沖洗終止反應(yīng)，伊紅襯染10 s，PBS沖洗，水性封片劑Clear mount封片，完全干燥后可用中性樹(shù)膠再次封片。

1.2.2 改良AchE酶組織化學(xué)反應(yīng)：反應(yīng)液由0.1 mol/L醋酸緩沖液（pH 5.8）6.5 mL，碘化乙酰硫代膽堿5 mg（Sigma），0.1 mol/L枸櫞酸鈉0.5 mL，5 mmol/L六氰基鐵酸鉀1 mL（Sigma），0.25 mol/ L硫酸銅溶液0.2 mL（Sigma）組成。反應(yīng)液37 ℃預(yù)熱，置入切片完全浸入，光鏡下觀察到黏膜下增生紊亂的神經(jīng)叢后停止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.2.3 HE染色方法：冰凍切片室溫下干燥，固定，PBS洗2 min，蘇木素染（37 ℃）1 min，PBS沖洗，95%乙醇5 s，伊紅染20～30 s，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.2.4 蛋白基因產(chǎn)物9.5（protein gene product 9.5，PGP9.5）免疫組織化學(xué)法：切片固定后加入封閉液1 h，兔抗人多克隆一抗PGP9.5（北京中杉），工作濃度1:200，置于4 ℃冰箱過(guò)夜，PBS沖洗，加入相應(yīng)二抗30 min，沖洗后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.2.5 β-III Tubulin （TUJ-1）免疫熒光：NADPH-d法染色完成后采集圖像，PBS沖洗5 min，枸櫞酸高壓法抗原修復(fù)，室溫冷卻，PBS沖洗。光鏡下再觀察，原NADPH-d陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)抗原修復(fù)后無(wú)變化，背景同未處理前一致。切片加入封閉液1 h，滴入鼠單克隆抗體TUJ-1（福州邁新生物）置4 ℃冰箱過(guò)夜，PBS沖洗，加入FITC標(biāo)記二抗，避光室溫1 h，熒光顯微鏡下觀察陽(yáng)性結(jié)果，PBS沖洗，加Hoechst33258（Sigma）染核5 min，PBS沖洗，加入防熒光淬滅劑，不同波長(zhǎng)下采集圖像，保存，Image Pro Plus 5.1軟件圖像重建分析。

1.2.6 觀察指標(biāo)：擴(kuò)張段、移行段的肌間神經(jīng)叢及黏膜下神經(jīng)叢著色情況、陽(yáng)性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是否可輕易識(shí)別，與背景有無(wú)反差。狹窄段黏膜下神經(jīng)叢有無(wú)增生、紊亂。腸神經(jīng)元特異標(biāo)記物TUJ-1及PGP9.5結(jié)果是否同NADPH-d及AchE法的結(jié)果一致。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用SPSS for windows 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。處理組間陽(yáng)性率比較采用配對(duì)x2檢驗(yàn)（校正），耗時(shí)比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 改良NADPH-d法擴(kuò)張段近端切緣切片滴加反應(yīng)液后5～10 min內(nèi)肉眼即可觀察到反應(yīng)液由澄黃變?yōu)榈仙?，低倍鏡下可見(jiàn)環(huán)肌和縱肌之間豐富的神經(jīng)叢，呈串珠狀分布，環(huán)肌層內(nèi)亦有大量陽(yáng)性神經(jīng)纖維及少許體積較小的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分布（見(jiàn)圖1）。高倍鏡下見(jiàn)陽(yáng)性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，胞核空白無(wú)著色，胞漿呈藍(lán)紫色（見(jiàn)圖2）。該法的組織切片背景單一，為無(wú)色半透明，經(jīng)伊紅襯染后，不僅陽(yáng)性神經(jīng)叢更易辨認(rèn)，環(huán)肌層間陽(yáng)性神經(jīng)纖維清晰可見(jiàn)，同時(shí)也提供了其他背景信息，如黏膜層及黏膜下層的情況（見(jiàn)圖3-4）。移行段低倍鏡下可見(jiàn)較少著色神經(jīng)叢，神經(jīng)叢體積較小，分布較稀疏；高倍鏡下神經(jīng)節(jié)細(xì)胞可清楚分辨，但單個(gè)神經(jīng)叢內(nèi)節(jié)細(xì)胞數(shù)量及大小較擴(kuò)張段明顯變小，環(huán)肌層陽(yáng)性神經(jīng)纖維少。狹窄段NADPH-d法染色后鏡下見(jiàn)背景清晰，無(wú)任何著色，未見(jiàn)NADPH-d陽(yáng)性神經(jīng)叢及陽(yáng)性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（見(jiàn)圖5）。

2.2 改良AchE法在擴(kuò)張段可見(jiàn)AchE陽(yáng)性肌間神經(jīng)叢及節(jié)細(xì)胞分布，近黏膜肌層有黏膜下神經(jīng)叢散在分布，量少（見(jiàn)圖6）。狹窄段AchE染色后見(jiàn)黏膜下層大量增生、肥厚、排列紊亂的AchE陽(yáng)性神經(jīng)叢，以近黏膜固有肌層為著。蘇木素復(fù)染后結(jié)果更易判斷（見(jiàn)圖7）。

2.3 HE染色擴(kuò)張段切片HE染色后，光鏡下見(jiàn)肌間神經(jīng)叢、神經(jīng)節(jié)細(xì)胞隱約可見(jiàn)，但不易識(shí)別，背景組織細(xì)胞極多，結(jié)果不易判斷。狹窄段HE染色，可見(jiàn)肌間雜亂分布的肥大神經(jīng)纖維束，無(wú)任何陽(yáng)性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。

2.4 PGP9.5免疫組化法擴(kuò)張段見(jiàn)大量陽(yáng)性神經(jīng)叢，其胞核、胞漿均著色，環(huán)肌層亦有大量陽(yáng)性神經(jīng)纖維遷入，與NADPH-d法的結(jié)果一致（見(jiàn)圖8）。移行段神經(jīng)叢分布相對(duì)稀疏。狹窄段黏膜下可見(jiàn)大量異常增生的PGP9.5陽(yáng)性神經(jīng)叢，與AchE結(jié)果一致（見(jiàn)圖9）。

2.5 TUJ-1免疫熒光為判斷NADPH-d陽(yáng)性節(jié)細(xì)胞及神經(jīng)叢的特異性，故對(duì)原先NADPH-d處理的切片（見(jiàn)圖1）再行高壓法抗原修復(fù)，加入神經(jīng)元特異性抗體TUJ-1進(jìn)行雙重染色分析，結(jié)果與NADPH-d陽(yáng)性部位一致，證實(shí)原先串珠狀分布的藍(lán)紫色組織，即為肌間神經(jīng)叢及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞。組織切片再加用Hoechst33258染核，細(xì)胞核顯色藍(lán)色熒光，背景顯示更清晰，組織層次分明，陽(yáng)性結(jié)果更易判斷。用Image Pro Plus 5.1專(zhuān)業(yè)軟件圖像重建，陽(yáng)性肌間神經(jīng)叢輕易可見(jiàn)（見(jiàn)圖10）。

2.6 NADPH-d法和AchE法結(jié)果比較診斷陽(yáng)性率NADPH-d法為94.4%（17/18），AchE法為88.9%（16/ 18），組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。耗時(shí)NADPH-d法最短，為（7.0±1.7）min，AchE法（30.9±2.2）min，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

圖1 擴(kuò)張段NADPH-d陽(yáng)性神經(jīng)叢及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（×100）

圖2 NADPH-d法顯示陽(yáng)性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（×400）

圖3 伊紅襯染后背景信息豐富（×40）

圖4 伊紅襯染后環(huán)肌層陽(yáng)性神經(jīng)纖維明顯（×100）

圖5 NADPH-d法狹窄段未見(jiàn)陽(yáng)性結(jié)果（×100）

圖6 擴(kuò)張段AchE陽(yáng)性神經(jīng)叢（× 100）

圖7 狹窄段黏膜下層異常增生神經(jīng)叢（× 100）

圖8 擴(kuò)張段PGP9.5陽(yáng)性神經(jīng)叢及環(huán)肌間神經(jīng)纖維（×100）

圖9 PGP9.5免疫組化顯示狹窄段異常增生的黏膜下神經(jīng)叢（×100）

圖10 TUJ-1免疫熒光（×100）

3 討論

酶組織化學(xué)是利用組織細(xì)胞內(nèi)酶具有催化某種反應(yīng)的特性來(lái)檢測(cè)酶活性。在一定的條件下（具有酶的底物等）全酶進(jìn)行催化作用，產(chǎn)生一種可見(jiàn)產(chǎn)物，沉淀在酶所在的部位，最終通過(guò)顯微鏡對(duì)酶的活性進(jìn)行定位或定量研究。酶組織化學(xué)法優(yōu)于傳統(tǒng)HE染色或免疫組化法，在于能發(fā)現(xiàn)組織里的代謝變化。Bruder等[1]指出AchE的酶組織化學(xué)反應(yīng)是超短段型巨結(jié)腸的獨(dú)特診斷方式。

我們改良了由NADPH-d等組成的快速酶組織化學(xué)染色方法，NADPH-d陽(yáng)性神經(jīng)即為氮能神經(jīng)，釋放內(nèi)源性NO，在腸神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)代表舒張因素。在HD的標(biāo)本中，我們發(fā)現(xiàn)擴(kuò)張段近端切緣NADPH-d陽(yáng)性神經(jīng)叢大量分布，環(huán)肌內(nèi)有大量陽(yáng)性神經(jīng)纖維遷入，說(shuō)明近端切緣已有正常腸神經(jīng)系統(tǒng)分布，符合手術(shù)要求。狹窄段腸管痙攣與缺乏產(chǎn)生NO神經(jīng)有關(guān)，而合成NO需要NADPH-d的催化，故狹窄段無(wú)上述表現(xiàn)[2]。故該結(jié)果可以供手術(shù)當(dāng)中診斷HD，評(píng)估狹窄段和移行段區(qū)域范圍，達(dá)到手術(shù)“精準(zhǔn)”的要求[3-4]。NADPH-d陽(yáng)性切片經(jīng)抗原修復(fù)后再用腸神經(jīng)特異性單克隆抗體TUJ-1驗(yàn)證，兩者陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞分布一致；用PGP9.5免疫組化再次驗(yàn)證陽(yáng)性細(xì)胞及神經(jīng)叢分布，結(jié)果也相符；說(shuō)明NADPH-d陽(yáng)性神經(jīng)節(jié)細(xì)胞即腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，故該方法可以準(zhǔn)確確認(rèn)腸管切緣[5-6]。不足之處是NADPH-d法染色背景較單一，黏膜下神經(jīng)叢反應(yīng)較弱。有趣的是，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中偶然使用了伊紅襯染，提供了豐富的背景信息，不僅陽(yáng)性神經(jīng)叢和環(huán)肌層陽(yáng)性神經(jīng)纖維更易辨認(rèn)，而且也獲知了黏膜層及黏膜下層的情況，這種復(fù)染方法，鮮有報(bào)道。但這僅是目前的一個(gè)初步研究結(jié)果，樣本均為典型HD病例，且樣本數(shù)不多，對(duì)于HD類(lèi)緣病診斷結(jié)果如何，尚需今后進(jìn)一步研究。

AchE陽(yáng)性神經(jīng)為乙酰膽堿能神經(jīng)，代表收縮因素，曾經(jīng)作為診斷HD的金標(biāo)準(zhǔn)[7]。我們?cè)讵M窄段黏膜下發(fā)現(xiàn)大量增生、扭曲的神經(jīng)叢，符合HD病理改變，亦與腸神經(jīng)元特異性標(biāo)記物PGP9.5免疫組化結(jié)果相符，說(shuō)明AchE法診斷HD切實(shí)可行。在HD病變段腸管中，AchE活性異常升高，通過(guò)顯色反應(yīng)可看到膽堿能神經(jīng)纖維大量增生，該技術(shù)由Karnovsky等[8]在1964年首次報(bào)道，現(xiàn)在被廣泛運(yùn)用。AchE化學(xué)染色對(duì)膽堿能纖維敏感，染色后可以識(shí)別出增生的膽堿能神經(jīng)纖維，該方法曾是證明黏膜以及黏膜下神經(jīng)干是否增粗的最好的技術(shù)之一，并且很適合在冰凍切片中使用，但在診斷神經(jīng)節(jié)細(xì)胞時(shí)特異性不是很高[2]。Nakao等[9]報(bào)道稱(chēng)單獨(dú)使用這一方法時(shí)，診斷HD的特異性約為91%。很多學(xué)者不斷對(duì)這種傳統(tǒng)的AchE組織化學(xué)染色方法進(jìn)行改進(jìn)，但完成整個(gè)過(guò)程仍需至少2 h，不僅耗時(shí)而且步驟復(fù)雜，較難應(yīng)用于術(shù)中快速診斷。我們提高了整個(gè)反應(yīng)體系溫度，反應(yīng)液配制后在37 ℃預(yù)熱，反應(yīng)在孵育箱內(nèi)進(jìn)行，結(jié)果能在30 min內(nèi)顯示。但同臨床術(shù)中快速診斷的要求還有差距，如果能通過(guò)今后進(jìn)一步改良各種反應(yīng)因素，完善反應(yīng)體系，AchE法可能還有更廣泛的應(yīng)用空間。我們認(rèn)為AchE法的優(yōu)勢(shì)在于對(duì)黏膜下異常增生神經(jīng)叢的診斷非常準(zhǔn)確，故特別適用于經(jīng)肛門(mén)吸引活檢的黏膜組織。國(guó)內(nèi)有學(xué)者曾報(bào)道用AchE染色方法，可以識(shí)別出增生的膽堿能神經(jīng)纖維，而正常組神經(jīng)纖維不顯色[10]。但我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)在正常腸壁亦有AchE陽(yáng)性肌間神經(jīng)叢及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分布，該結(jié)果與Kobayashi等[11]報(bào)道的一致。

目前用于診斷HD最常用的方法還是HE染色法。該方法作為病理檢查的基礎(chǔ)，各級(jí)醫(yī)院中均可開(kāi)展，但對(duì)于識(shí)別發(fā)育未成熟、結(jié)構(gòu)不典型的神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有一定局限性，直接影響診斷準(zhǔn)確率。Maia[2]曾報(bào)道術(shù)中快速冰凍HE染色診斷HD患者與病理檢查的一致性約為89%，這比其他需要進(jìn)行術(shù)中快速冰凍切片診斷的病例與常規(guī)病理檢查一致性低。HD術(shù)中快速冰凍HE診斷錯(cuò)誤的概率不是很高，但是對(duì)患病兒童造成的后續(xù)影響很大。

總之，不同方法在診斷HD時(shí)各有優(yōu)點(diǎn)，也有不容忽視的局限性。改良后的NADPH-d法適用于術(shù)中快速診斷HD，確定腸管切除范圍，最大優(yōu)勢(shì)在于快速、陽(yáng)性結(jié)果易識(shí)別。因狹窄段肌間無(wú)NADPH-d表達(dá)，故NADPH-d法也適用于術(shù)前直腸肌層活檢的診斷。AchE法的優(yōu)勢(shì)在對(duì)于黏膜下異常增生神經(jīng)叢的診斷，特別適用于經(jīng)直腸黏膜吸引活檢的組織，但顯色的主要是膽堿能神經(jīng)纖維，并不能很好地顯示神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，因此用作術(shù)中快速診斷HD仍有一定局限性。

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（本文編輯：胡苗苗）

Diagnosis of Hirschsprung’s disease with modified NADPH-d and AchE enzyme histochemistry

ZHULibin, ZHANG Hua, LIN Jinhan, DAI Lina, HUANG Huang, LI Zhongrong.
Department of Pediatric Surgery, the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective: To assess the superiorities of modified NADPH-diaphorase (NADPH-d) and acetylcholinesterase (AchE) enzyme histochemistry staining technique to diagnose Hirschsprung’s disease (HD). To increase the identification of ganglion cells in the boundary of the bowel in HD and decrease the risks of reoperation.Methods:Full-thickness colon samples of 18 children with HD (girl 7 cases, boy 11 cases ), with average age (8.6±3) months, were examined. Frozen sections at three levels (narrow segment, transitional segment and dilated segment) were performed and investigated to determine the extent of aganglionosis by modified NADPH-d and AchE staining respectively, which were compared by traditional HE staining. TUJ-1 (β-III Tubulin) and PGP9.5(Protein Gene Product 9.5), markers of enteric neural cells, were used for identification of positive myenteric plexus and ganglion cells by immunofluorescence or immunohistochemistry.Results:NADPH-d staining could rapidly confirm whether the normal ganglion cells existed at the proximal end of the resected bowel. AchE technique clearly stained submucosal hypertrophic nerve trucks in aganglion segments. The specifica identifications of HD, NADPH-d staining was 94.4% (17/18), and AchE staining was 88.9% (16/18), respectively (P> 0.05). Time comsuming was (7.0±1.7) min in NADPH-d, and (30.9±2.2) min in AchE, respectively (P<0.01). The results of two modified methods mentioned above were in keeping with TUG-landPGP 9.5.Conclusion:Modified NADPH-d staining can rapidly confirmed whether the ganglion cells distribute at proximal end of resected bowel and it is suitable for rapidly intraoperative diagnosis of HD. AchE staining is the best technique to demonstrate hypertrophic nerve trunks in the submucosa and is suitable for diagnosing samples of suction rectal biopsy.

Hirschsprung’s disease; diagnosis; enzyme histochemistry; colorectal surgery

R726.1

A

1000-2138（2014）01-0031-05

2013-01-29

浙江省衛(wèi)生廳科研基金資助項(xiàng)目（2009A149）。

朱利斌（1977-），男，浙江臺(tái)州人，主治醫(yī)師，碩士。

李仲榮，教授，博士生導(dǎo)師，Email：wmclzr@163.com。