倪 艷，鄭環(huán)宇,**，董小超，白小娟，朱秀清,，韓建春,

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)/國(guó)家大豆工程技術(shù)研究中心/黑龍江省大豆技術(shù)開發(fā)研究中心，哈爾濱 150028；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，哈爾濱 150030）

大豆作為主要的農(nóng)作物之一，在世界各地都有大面積的種植。大豆含有豐富的人體必需八種氨基酸且其組分平衡，是人和畜禽優(yōu)質(zhì)的植物蛋白源。近年來，隨著大豆蛋白分離技術(shù)的不斷改進(jìn)，大豆蛋白制品的口感和食品功能性得到完善，被廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域，例如在嬰兒奶粉、腸、休閑食品等各類加工食品中都有大豆分離蛋白的添加。但是隨著大豆蛋白被廣泛應(yīng)用于食品中，大豆蛋白中含有的致敏性蛋白會(huì)導(dǎo)致部分成人、嬰兒引發(fā)過敏反應(yīng)，使這些人群食用大豆蛋白面臨著危險(xiǎn)，因此這就使去除大豆致敏蛋白顯得尤為重要[1]。文中對(duì)大豆致敏蛋白的分類、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、目前采用的去除方法、存在問題及今后研究發(fā)展方向等進(jìn)行了綜述。

1 大豆主要致敏蛋白的分類

大豆致敏蛋白是指大豆及其制品中能引起人或畜禽產(chǎn)生過敏反應(yīng)的一些大分子蛋白質(zhì)或糖蛋白，被稱為八大主要食物過敏源之一。目前的研究表明，大豆主要致敏蛋白按其沉降系數(shù)可分為11S、7S和2S 3種，其中大豆球蛋白屬于11S組分；β-伴大豆球蛋白、Glym Bd 30K和Glym Bd 28K屬于7S組分；胰蛋白酶抑制劑屬于2S組分。

1.1 大豆球蛋白

大豆球蛋白分別占大豆籽實(shí)總蛋白的19.5%～23.1%和總球蛋白的40%。大豆球蛋白是由6個(gè)亞基組成的，其中每個(gè)亞基由一條酸性肽鏈即A鏈（A1、A2、A3、A4、A5、A6）和一條堿性肽鏈即B鏈（B1、B2、B3、B4、B5、B6）構(gòu)成，而這兩條肽鏈又通過二硫鍵連接起來，形成2個(gè)比較穩(wěn)定的環(huán)狀六角形結(jié)構(gòu)，且酸性肽鏈比堿性肽鏈更容易水解。大豆球蛋白的分子質(zhì)量為300～350 kDa，其中酸性亞基分子質(zhì)量為31～45 kDa，等電點(diǎn)（PI）為4.8～5.5；堿性亞基分子量為18～20 kDa，等電點(diǎn)（PI）為6.5～8.5[2]。研究表明，大豆球蛋白的單體共有5種存在形式，分別是A1aB2（53.6 kDa）、A1bB2（52.2 kDa）、 A2B1a（52.4 kDa）、 A3B4（55.4 kDa）和A5A4B3（61.2 kDa）[3]。

1.2 β-伴大豆球蛋白

β-伴大豆球蛋白占大豆籽實(shí)總蛋白的10.0%～12.7%，占總球蛋白的30%，占大豆7S球蛋白的50%以上[4]。β-伴大豆球蛋白是一個(gè)三聚體糖蛋白，分子質(zhì)量為150～175 kDa，由α、α′、β3個(gè)亞基組成，他們的分子質(zhì)量分別為68 kDa、72 kDa、53 kDa。3個(gè)亞基中，天冬氨酸/天門冬酰胺、谷氨酸/谷氨酰胺、亮氨酸和精氨酸的含量較豐富，含硫氨基酸較少，特別是不含半胱氨酸，且熱穩(wěn)定性為β＞α′＞α[5]。目前已經(jīng)鑒定清楚的β-伴大豆球蛋白有6 種聚合形式，分別為αβ1、αβ2、αα′β、α2β、αα2、α3。β－伴大豆球蛋白的3個(gè)亞基都具有潛在的致敏性，而其中的α亞基即Gly m Bd 60K，最重要也是最容易被遺傳過敏性皮炎患者的血清IgE抗體所識(shí)別[6]。Glym Bd 60K也是一種糖蛋白，其等電點(diǎn)為4.9。β－伴大豆球蛋白與大豆球蛋白相比，其熱穩(wěn)定性和凝膠能力較差，但乳化能力比大豆球蛋白強(qiáng)[7]。

1.3 Glym Bd 30K

Glym Bd 30K含量低于大豆蛋白總含量的l%[8]，分子質(zhì)量為30～34 kDa，等電點(diǎn)為4.5，又被稱為大豆油脂體相關(guān)蛋白P34[9]，屬于木瓜蛋白酶超家族，是致敏性最強(qiáng)的致敏蛋白，能被65%的大豆過敏患者血清識(shí)別，而2010年Gagnon利用2-D電泳IgE Western-blotting，認(rèn)為大豆蛋白中致敏性最強(qiáng)的是11S球蛋白中的酸性多肽（A3多肽），而不是Glym Bd 30K[10]。

研究表明，Glym Bd 30K（P34）由257個(gè)氨基酸殘基組成，是一種單分子、不溶于水的糖蛋白，他的多糖組成為甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖、巖藻糖、木糖，分別以3:2:1:1的比例存在，Glym Bd 30K（P34）的糖基化位點(diǎn)位于成熟蛋白的第170位天冬酰胺處[11]。目前已經(jīng)鑒定出5個(gè)抗原表位，分別位于3-12、100-110、229-238、299-308和331-340位的氨基酸殘基上[12]。他含有較多的天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等氨基酸[13]。

1.4 Glym Bd 28K

Glym Bd 28K是由220個(gè)氨基酸殘基組成的糖蛋白，其含量低于Glym Bd 30K，分子質(zhì)量為26 kDa，等電點(diǎn)（PI）為6.1，屬于Cupin蛋白家族。他的多糖組成和比例與Glym Bd 30K的多糖相同。聚糖基團(tuán)以N-連接的方式與位于Glym Bd 28K蛋白的氨基酸序列上的第20位的天冬酰胺連接[13]。他含有較多的天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、精氨酸等氨基酸[14]。通過研究Glym Bd 28K的抗原表位，發(fā)現(xiàn)其主要的線性C-末端與IgE結(jié)合的抗原表位位于S256和A270之間，用丙氨酸掃描技術(shù)研究抗原結(jié)構(gòu)域染色質(zhì)伸展活性，定位了5個(gè)與IgE結(jié)合頻率最高的氨基酸殘基為Y260，D261，D262，K264 和D266[15]。Glym Bd 28K的糖基化位點(diǎn)可能是IgE抗體識(shí)別的重要表位，去糖基化后的糖蛋白不能與過敏患者血清中IgE抗體特異結(jié)合，推斷N-連接聚糖部分就是一般植物性蛋白的IgE反應(yīng)活性決定域[12]，但是，同樣是大豆中的致敏糖蛋白，對(duì)β-伴大豆球蛋白水解后的肽段進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)，卻發(fā)現(xiàn)與IgE結(jié)合的肽段并非糖肽[6]，所以認(rèn)為糖基并不是所有糖蛋白與IgE連接的必要條件。

1.5 大豆胰蛋白酶抑制劑

大豆胰蛋白酶抑制劑分為2類，Browan-Birk（BBI）型抑制劑和Kuniz（KTI）型抑制劑，分別占大豆脫脂粉重的1.4%和0.6%。BBI型抑制劑對(duì)熱、酸和胃酶不穩(wěn)定，而KTI型抑制劑不僅穩(wěn)定，而且對(duì)胰凝乳蛋白酶的作用能力很強(qiáng)。BBI是由71個(gè)氨基酸所組成的單肽鏈，含有7個(gè)二硫鍵，分子質(zhì)量為8 kDa。KTI是由181個(gè)氨基酸組成的單肽鏈，含有2個(gè)二硫鍵，分子質(zhì)量為20.1 kDa，由8個(gè)亞基組成，分別為 Tia、Tib、Tibi5、Tic、Tid、Tie、Tif和Ti-null型。

1.6 其他致敏蛋白

除上述主要的大豆致敏原外，還有一些其他致敏原的存在，主要有大豆疏水蛋白Glym 1，存在于種子表面，有2個(gè)亞型Glym 1 A和Glym 1 B，其分子量分別為7.5 kDa和7 kDa[16]；大豆外殼蛋白Glym 2，存在于豆莢中，分子質(zhì)量為8 kDa，PI為6.0[15]；大豆抑制蛋白Glym 3，存在于豆莢中，分子質(zhì)量為14 kDa，PI為4.4[17]。這些致敏蛋白含量較低且熱穩(wěn)定性較差。

2 大豆致敏蛋白的清除處理方法

目前大豆致敏蛋白的清除方法主要有加工處理及育種改良等手段。

2.1 加工處理

2.1.1 熱處理 熱處理在國(guó)內(nèi)食品加工和飼料加工中是一種常用的方法，可以使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變性，從而破壞其空間構(gòu)象，進(jìn)而在一定程度上可降低其致敏性。Lakemond等研究發(fā)現(xiàn)高溫會(huì)引起大豆球蛋白空間構(gòu)象及三維結(jié)構(gòu)的變化[18]，即加熱到一定程度可以降低其致敏性或去除致敏性。

劉曉毅等將生大豆通過熱處理（60、70、80、90和100℃浸泡3 h）后[19]，蛋白質(zhì)電泳分析表明，分子質(zhì)量為68K的致敏蛋白對(duì)熱不穩(wěn)定，能有效去除；30K和28K對(duì)熱都穩(wěn)定，不能有效去除，因此采用熱處理不能有效去除大豆中30K和28K兩種致敏蛋白。

2.1.2 熱蒸汽處理 孫鵬等將大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白分別從生、熟（120℃，7.5min）大豆中分離純化及電泳分析鑒定[20]。將鑒定后的純化致敏原皮下注射昆明小鼠，利用瓊脂擴(kuò)散及免疫酶技術(shù)檢測(cè)所得抗血清與原有致敏原是否發(fā)生免疫應(yīng)答。結(jié)果表明，蒸汽處理能使大豆球蛋白含量明顯減少，致敏性喪失；而β-伴大豆球蛋白經(jīng)同樣處理后，含量雖有降低，但其致敏性卻仍然存在。

2.1.3 擠壓膨化處理 席鵬彬等研究不同溫度濕法擠壓膨化大豆對(duì)斷奶仔豬皮褶厚度及腹瀉的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)[21]，150℃膨化大豆日糧能減輕斷奶仔豬過敏反應(yīng)及下痢程度，因此可知，擠壓膨化技術(shù)在一定程度上能有效滅活生大豆中的大豆致敏蛋白，改善其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

2.1.4 超高壓處理 超高壓就是利用100 MPa以上的壓力，在常溫或較低溫度下，使食品中的酶、蛋白質(zhì)和淀粉等生物大分子改變活性、變性或糊化，而食品的天然味道、風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值不受或很少受到影響，并可能產(chǎn)生一些新的質(zhì)構(gòu)特點(diǎn)的一種加工方法。

Tang等研究表明[22]，在大于或是等于300MPa高壓的條件下，大豆球蛋白不但解離為亞基，而且這些亞基的構(gòu)象也發(fā)生了改變，同時(shí)含硫基團(tuán)、疏水區(qū)域以及紫外吸收能力的氨基酸數(shù)量也增加了很多；經(jīng)400MPa、10min處理，大豆球蛋白會(huì)完全變性；經(jīng)500MPa、10min處理，大豆球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋和β-折疊被完全破壞并轉(zhuǎn)變?yōu)闊o規(guī)則卷曲。而Penas等研究發(fā)現(xiàn)[23]，大豆中的7S球蛋白（β-伴大豆球蛋白）在300MPa和400MPa高壓條件下，都會(huì)變性失活。此后又進(jìn)一步研究并發(fā)現(xiàn)，在200MPa和300MPa條件下，大豆中的Glym 1的致敏性也大幅度降低[24]。Huijing Li的研究表明在300MPa下高靜壓力處理15min可以使大豆分離蛋白的總致敏性降低48.6%[25]。Elena Penas的研究表明300MPa，15min，40℃超高壓處理可以降低大豆芽的抗原性，但卻使大豆的抗原性增加[26]。

高壓靜電場(chǎng)處理的原理是使離子化的氣體在電場(chǎng)內(nèi)移動(dòng)，向物質(zhì)的散體微粒傳遞電荷，而蛋白質(zhì)本身就是帶電的電介質(zhì)；而且有報(bào)道稱酶在電場(chǎng)的作用下生理活性會(huì)有所改變。

然而劉曉毅采用高壓靜電場(chǎng)（30 KV負(fù)壓）處理大豆蛋白溶液（2%濃度）[27]，研究此種處理方式對(duì)致敏性的影響時(shí)卻發(fā)現(xiàn)，這種方式不會(huì)改變蛋白質(zhì)的組成，ELISA測(cè)得抗體滴度也表明，蛋白與IgE的結(jié)合能力僅降低了3.2%。

2.1.5 鹽析處理 劉曉毅采用pH值配合鹽析（Na2SO4處理大豆蛋白提取液后調(diào)pH值）處理[27]，結(jié)果顯示，當(dāng)pH值調(diào)至6.1時(shí)，28K被完全去除，但30K和68K未得到有效去除。而當(dāng)pH4.5時(shí)對(duì)30K和28K的去除效果較好，因此將鹽析和pH值處理結(jié)合起來可以有效去除大豆致敏蛋白30K和28K，但是不能去除68K。

2.1.6 糖基化處理 Tsuji等通過用多糖修飾致敏位點(diǎn)來降低大豆致敏蛋白的致敏能力[28]。采用方法為將大豆蛋白與半乳甘露聚糖按質(zhì)量比1:5混合，然后經(jīng)冷凍干燥，在相對(duì)濕度為79%，溫度60℃條件下誘發(fā)美拉德反應(yīng)，結(jié)果表明大豆蛋白的致敏能力得到了有效的降低。而Babiker等通過在Glym Bd 30K上連接了一個(gè)半乳甘露聚糖[29]，

結(jié)果也發(fā)現(xiàn)此復(fù)合物和過敏患者血清及Glym Bd 30K單克隆抗體不能發(fā)生反應(yīng)。說明糖基化是一種有效的使大豆致敏蛋白脫敏的方法。

2.1.7 化學(xué)試劑處理 Samoto等研究表明[30]，去脂豆?jié){在一定條件下（1moL/L Na2SO4，pH4.5）加入還原劑（10 mmoL/L Na2SO3）后離心，Glym Bd 30K約有97%以沉淀形式被除去，而其他主要的大豆蛋白在離心后留在了上清液中。

2.1.8 酶處理 Yamanishi等將大豆在37℃下用蛋白酶處理20 h[31]，經(jīng)免疫印跡和ELISA檢測(cè)表明，其不能與F5單克隆抗體及患者血清發(fā)生免疫反應(yīng)，這說明酶解法能有效的去除過敏蛋白。而劉曉毅研究體內(nèi)蛋白酶的體外消化實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)[27]，胃蛋白酶能水解大豆蛋白的各個(gè)亞基，當(dāng)用10%濃度的脫脂大豆粉為底物，酶添加量0.5%（W/W）時(shí)，胃蛋白酶水解lh，致敏性下降80%，免疫印跡也表明此時(shí)的蛋白水解物不能和患者血清IgE發(fā)生反應(yīng)。王之盛等采用復(fù)合酶制劑（酸性蛋白酶60%、堿性蛋白酶20%、纖維素酶10%、淀粉酶8%、脂肪酶2%）處理豆粕和生大豆[32]，結(jié)果表明，復(fù)合酶制劑在不同pH值條件下對(duì)致敏蛋白的作用不同，對(duì)生大豆的酶解效果比豆粕好；在酸性條件下有利于生大豆中11S致敏蛋白的降解，在堿性條件下有利于豆粕中致敏蛋白的降解，中性條件下有利于7S和2S小分子量致敏蛋白的降解。Penas等采用酶和超高壓結(jié)合對(duì)致敏蛋白的作用效果時(shí)發(fā)現(xiàn)[23]，在100MPa時(shí)，3種酶的水解活性相似，而在200MPa和300MPa時(shí)，其水解程度明顯增強(qiáng)。其中在所有條件下，經(jīng)過堿性蛋白酶和CorolasePN－L處理后的豆?jié){液都不在呈現(xiàn)出致敏性。而在0.1 MPa、100MPa和200MPa條件下，中性蛋白酶的水解產(chǎn)物中能檢測(cè)到70 kDa致敏分子，在300MPa條件下卻沒檢測(cè)到致敏分子的存在。因此說明，高壓條件有助于酶解法去除大豆中的致敏蛋白。

2.1.9 微生物發(fā)酵處理 Frias和Young Soo Song等用米曲霉、米根霉和枯草芽孢桿菌對(duì)大豆種子進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵[33-34]，用胚芽乳桿菌對(duì)碾米大豆進(jìn)行液態(tài)發(fā)酵。結(jié)果顯示，在固體發(fā)酵中，用米曲霉和米根霉進(jìn)行發(fā)酵的產(chǎn)品其致敏性分別降低了66%和68%，用枯草芽孢桿菌接種的樣品其致敏性分別減少了81%～86%。在液態(tài)發(fā)酵中，胚芽乳桿菌發(fā)酵的豆粕免疫球蛋白IgE的致敏性降低了96%～99%。

2.2 育種改良

2005年，Herman等借助基因槍法用Glym Bd 30K的沉默載體pKS73轉(zhuǎn)化大豆體細(xì)胞[35]，成功的抑制了轉(zhuǎn)基因大豆的Glym Bd 30K蛋白合成，得到了缺失致敏蛋白Glym Bd 30K的轉(zhuǎn)基因大豆。劉珊珊等用黑龍江省第二積溫帶主栽中熟高油大豆品種東農(nóng)47為受體材料[36]，以致敏蛋白缺失、7S球蛋白亞基組成為[（α′+α）+11S酸性亞基]缺失型日本引進(jìn)育種材料“日B”為供體親本配制組合，于2008年創(chuàng)制了大豆7S球蛋白α-亞基（Glym Bd 60K致敏蛋白）缺失型新種質(zhì)。

2.3 結(jié)論

綜上所述目前國(guó)內(nèi)外所采用的各種去除大豆致敏蛋白的方法都存在一定的優(yōu)缺點(diǎn)。

熱加工雖會(huì)破壞蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)從而降低大豆蛋白的致敏性，但是對(duì)一些熱穩(wěn)定的致敏蛋白的作用效果不明顯。同時(shí)加熱過程中的溫度不好控制，而大豆含蛋白高，淀粉低，且大豆蛋白中較高的賴氨酸在溫度過高時(shí)易與一些還原糖發(fā)生美拉德反應(yīng)，降低賴氨酸的有效性。同時(shí)溫度過高還會(huì)導(dǎo)致大豆一些非致敏蛋白變性，從而影響其功能性。

糖基化雖然能有效的去除個(gè)別大豆致敏原，但是引入多糖基團(tuán)會(huì)不會(huì)導(dǎo)致新的致敏原產(chǎn)生目前仍存在較大爭(zhēng)議。

添加化學(xué)試劑的方法，在很大程度甚至完全除去大豆中致敏蛋白的同時(shí)也會(huì)造成產(chǎn)品中的化學(xué)物質(zhì)的殘留，這可能會(huì)對(duì)人體造成傷害，而后期除去化學(xué)物質(zhì)又會(huì)增加加工成本。

通過育種的方法雖然能從根本上改良大豆的蛋白品質(zhì)，徹底清除致敏蛋白，而且可以減少為清除大豆蛋白的致敏作用所必需的加工工藝，從而大大降低深加工成本，有效保證大豆蛋白及其制品的高效利用，但是在轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性上，至今仍飽受爭(zhēng)議。

酶水解處理是降低大豆蛋白致敏性的安全有效方法，但是其作用程度受酶的種類、水解程度以及水解前處理等諸多因素的影響。因此，想要特異、有效地降低或去除特定的致敏原，還應(yīng)該更加深入地了解該致敏蛋白的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

然而超高壓技術(shù)在食物過敏方面的應(yīng)用目前還是空白階段，但是超高壓環(huán)境能夠改變大豆球蛋白的原有構(gòu)象，這些構(gòu)象的變化必定會(huì)對(duì)其過敏原性產(chǎn)生影響。因此，超高壓技術(shù)在大豆蛋白脫敏方面的應(yīng)用將具有潛在的前景。

3 存在問題與未來研究方向

大豆蛋白作為優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源對(duì)我國(guó)的食品工業(yè)和飼料加工業(yè)等有著十分重要的意義，能否找到一種更加完善的清除大豆致敏蛋白的加工方法關(guān)系到大豆蛋白利用方面的成功與否。目前對(duì)于食品工作者在去除大豆致敏原方面存在的困難，首先，大豆致敏患者血清來源較難獲得；其次，大豆致敏蛋白的種類較多且結(jié)構(gòu)復(fù)雜；最后，去除主要大豆致敏蛋白的同時(shí)又能保證大豆蛋白的功能特性不受到影響。

當(dāng)今食品安全問題層出不斷，大豆分離蛋白、大豆?jié)饪s蛋白等在各類食品中的廣泛添加，也必將使大豆致敏蛋白的檢測(cè)成為食品安全檢測(cè)的重要方面。就目前的研究來看，我國(guó)在去除大豆致敏源方面的研究相對(duì)較少，特別是在食品加工方面，而研究大豆蛋白的脫敏方法主要采用的也是單一的處理方法，這在一定程度上很難將致敏原徹底清除。未來在清除大豆致敏原方面主要應(yīng)從以下幾方面進(jìn)行研究，第一，各種主要致敏蛋白結(jié)構(gòu)差異和共性及致敏機(jī)理的研究；第二，采用多種處理方法聯(lián)合對(duì)去除致敏蛋白作用效果的研究。

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