唐蘇銘，周曉航，李黎明，關(guān)一夫

（1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，沈陽110001；2.東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院生物技術(shù)研究所，沈陽110819）

無鎳不銹鋼金屬支架材料對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)機(jī)制

唐蘇銘1，周曉航1，李黎明2，關(guān)一夫1

（1.中國醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，沈陽110001；2.東北大學(xué)生命科學(xué)與健康學(xué)院生物技術(shù)研究所，沈陽110819）

目的研究高氮無鎳不銹鋼（HNNF SS）材料對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響。方法應(yīng)用Annexin V-FITC/PI染色和流式細(xì)胞分析術(shù)檢測貼附于HNNF SS和對照組316L不銹鋼（316L SS）材料表面的人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的凋亡水平；實(shí)時(shí)定量PCR檢測凋亡相關(guān)基因和microRNA（miRNA）的表達(dá)水平。結(jié)果流式細(xì)胞結(jié)果表明316L SS比HNNF SS能更有效地激活細(xì)胞凋亡（P＜0.05），生長在316L SS上的HUVECs中Fas、Caspase-3和Caspase-8基因過表達(dá)，2種材料上生長的HUVECs中miR -133a、186、210、34a和124含量高于空白對照組（P＜0.05）。結(jié)論316L SS激活細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與鎳離子激活Fas-Caspase -8-Caspase-3外源性凋亡通路相關(guān)，此信號通路也受miRNA調(diào)節(jié)，實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果顯示了相關(guān)基因及miRNA的表達(dá)差異。提示HNNF SS在避免細(xì)胞凋亡，減緩支架植入再狹窄方面優(yōu)于316L SS材料。

金屬鋼架；血管內(nèi)皮；細(xì)胞凋亡；microRNA

經(jīng)皮穿刺冠狀動(dòng)脈成型術(shù)（percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA）植入血管支架是治療動(dòng)脈粥樣硬化性冠心病的主要手段，但PTCA術(shù)后常發(fā)生支架內(nèi)再狹窄（in-stent restenosis，ISR）［1］。ISR的主要機(jī)制是支架植入引起血管內(nèi)皮損傷，導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞向損傷部位遷移及血栓形成［2］。316L是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的冠狀動(dòng)脈支架材料，其鎳元素含量為10%～14%，植入后鎳等金屬離子會(huì)由于腐蝕作用釋放到周圍組織，可引起接觸過敏，加重炎性反應(yīng)，刺激支架周圍組織增生，從而增加ISR的機(jī)會(huì)［3］。新型高氮無鎳不銹鋼（high nitrogen nickelfree austenitic stainless steel，HNNF SS）與傳統(tǒng)的316L SS金屬材料相比，具有更好的強(qiáng)韌性、優(yōu)良的耐腐蝕性和血液相容性［4］。本研究擬觀察316L SS及改良的0.62N含氮無鎳不銹鋼材料對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響并探討相關(guān)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），胎牛血清（美國Invitrogen公司），胰蛋白酶（美國Gibco公司），QIAGEN RNeasy mini kit RNA提取試劑盒（德國QIAGEN公司），SYBR?RPremix Ex TaqTMⅡ（日本TaKaRa公司），Prime Script RT reagent Kit（日本Ta-KaRa公司），Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展公司）。實(shí)驗(yàn)用316L SS和HNNF SS（直徑12和33 mm，厚度1 mm）均由中科院金屬研究所提供。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）購自南京凱基生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組：于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，在添加10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)HUVECs。取處于對數(shù)生長期的HUVECs，制成細(xì)胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板中（5×103/孔）。將細(xì)胞接種于空白6孔板中，設(shè)為空白對照組；將表面積相同的316L SS、HNNF SS金屬片分別置于6孔板不同培養(yǎng)孔中后，將細(xì)胞接種于金屬片表面，分別設(shè)為316L SS組和HNNF SS組。3組均為2 mL細(xì)胞培養(yǎng)體系。

1.2.2 凋亡檢測：各組細(xì)胞培養(yǎng)7 d后，無EDTA胰酶消化并收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS緩沖液清洗細(xì)胞2次，收集細(xì)胞（1×106/mL）。加入1×Binding Buffer緩沖液（500 μL/管）和Annexin-ⅤFITC 5 μL，輕輕混勻，再加入碘化丙錠5 μL，混勻。室溫（20～25℃）避光處放置15 min，流式細(xì)胞儀測定。

1.2.3 實(shí)時(shí)RT-PCR：用QIAGEN RNeasy mini kit試劑盒提取HUVECs總RNA，用AMV反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄2 μg RNA，用于凋亡相關(guān)基因?qū)崟r(shí)定量RT-PCR檢測。利用AMV反轉(zhuǎn)錄酶和莖環(huán)引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用于miRNA定量RT-PCR檢測。用Primer5.0設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增寡聚核苷酸引物（表1、2）。計(jì)算凋亡相關(guān)基因水平的內(nèi)參為GAPDH，計(jì)算miRNA表達(dá)水平的內(nèi)參為U6，計(jì)算基因表達(dá)水平=2-ΔΔCt，對照組設(shè)置為1。

表1 細(xì)胞凋亡檢測的基因名稱及引物序列Tab.1 Primers’sequences for the apoptosis?related genes

表2 用于miRNA檢測的基因名稱及引物序列Tab.2 Primers’sequences for the apoptosis?related microRNA

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS10.1統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 無鎳不銹鋼金屬支架材料對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞分析結(jié)果如圖1所示：316L SS組和HNNF SS組HUVECs早期凋亡和晚期壞死水平均高于空白對照組（P＜0.05），但316L SS組HUVECs比HNNF SS組能更有效地激活早期細(xì)胞凋亡（P＜0.05），而在晚期壞死水平上則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖1 無鎳不銹鋼材料對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響Fig.1 The effects of nickel?free steel on the apoptosis of endothelial cells

2.2 HNNF SS對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及miRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)

如圖2所示：316L SS組HUVECs中Fas、Caspase-3和Caspase-8基因表達(dá)水平顯著高于空白對照組（P＜0.05），HNNF SS組HUVECs中Caspase-8表達(dá)水平顯著低于316L SS組（P＜0.05）。如圖3所示：HNNF SS組和316L SS組HUVECs中miR-133a、186、210、34a和124含量均高于空白對照組（P＜0.05）。

圖2 無鎳不銹鋼材料對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)Fig.2 The effects of nickel?free steel on the expression of apoptosis?related genes in endothelial cells

3 討論

臨床研究表明，血管內(nèi)皮細(xì)胞的功能可影響ISR的發(fā)生。冠心病患者病變血管的內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，而支架的植入可加劇血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷。內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙所致的凋亡是再狹窄發(fā)生的潛在機(jī)制［1，2，5］。Koster等［6］研究了不銹鋼支架中鎳、鉻、鉬等金屬離子釋放引起過敏反應(yīng)與ISR之間的關(guān)系，認(rèn)為支架釋放的金屬離子，特別是鎳，引起接觸過敏，加重炎性反應(yīng)，刺激支架周圍組織增生，從而增加ISR可能［6，7］。此外，體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也表明鎳離子能抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［8］。本研究檢測了不同材料對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：雖然生長在316L SS和HNNF SS上的內(nèi)皮細(xì)胞早期凋亡和晚期壞死水平都高于空白對照組，但316L SS比HNNF SS能更有效地激活早期細(xì)胞凋亡。提示HNNF SS材料對內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用較小，可緩解金屬支架導(dǎo)致的血管再狹窄，具有開發(fā)潛力。

圖3 無鎳不銹鋼材料對血管內(nèi)皮細(xì)胞microRNA表達(dá)的影響Fig.3 The effects of nickel?free steel on the expression of apoptosis?related microRNA in endothelial cells

目前認(rèn)為，細(xì)胞凋亡主要是通過細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)信號途徑實(shí)現(xiàn)的：（1）Fas是一種跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體超家族成員，它與配體FasL結(jié)合，募集Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（Fas-associated with death domain protein，F(xiàn)ADD），形成死亡誘導(dǎo)復(fù)合體（death-inducing signaling complex，DISC），進(jìn)而經(jīng)過Bid蛋白激活Caspase-8為代表的級聯(lián)反應(yīng)，最終激活Caspase-3并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；（2）通過線粒體膜上蛋白再分布影響線粒體膜電位和通透性，釋放某些凋亡啟動(dòng)因子和細(xì)胞色素c，進(jìn)而激活Caspase-9等級聯(lián)放大反應(yīng)，最終激活Caspase-3并誘導(dǎo)凋亡。其中Fas通路在Bid蛋白介導(dǎo)下，可實(shí)現(xiàn)與線粒體途徑的交聯(lián)對話［9，10］。本研究結(jié)果顯示，培養(yǎng)于316L SS金屬片上的HUVECs中Fas、Caspase-3和Caspase-8基因的表達(dá)水平均高于空白對照組，提示316L SS金屬片可能通過Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑誘導(dǎo)HUVECs的凋亡。另外，培養(yǎng)在316L SS和HNNF SS金屬片上的HUVECs中Caspase-9mRNA水平與對照組相比無顯著差異，因此，推測316L SS金屬材料可能主要通過外源性途徑，即Fas介導(dǎo)的凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

microRNA是近年來發(fā)現(xiàn)的一種內(nèi)源性、非編碼小分子RNA。它能對基因活動(dòng)的各個(gè)方面進(jìn)行調(diào)節(jié)，包括早期胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡、脂肪代謝等［11］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在316L SS和HNNF SS材料上生長的HUVECs中，miR-133a、186、210、34a和124的含量均升高，提示這些microRNA可能參與凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)的調(diào)控。但miRNA表達(dá)與凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)趨勢不一致，這可能是由于microRNA參與多種基因的調(diào)控，有凋亡以外的信號傳導(dǎo)通路保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷的機(jī)制存在。

總之，316L SS激活細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與鎳離子激活Fas-Caspase-8-Caspase-3外源性凋亡通路相關(guān)，此信號通路也受miRNA調(diào)節(jié)。實(shí)時(shí)定量PCR檢測顯示了相關(guān)基因及miRNA的表達(dá)差異。以上結(jié)果提示HNNF SS在避免細(xì)胞凋亡、減緩支架植入再狹窄方面優(yōu)于316L SS材料。

［1］Iijima R，Ikari Y，Amiya E，et al.The impact of metallic allergy on stent implantation：metal allergy and recurrence of in-stent restenosis［J］.Int J Cardiol，2005，104（3）：319-325.

［2］賈東煜，王貴學(xué).血管支架內(nèi)再狹窄相關(guān)因素與機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2007，11（35）：7061-7064.

［3］Herting G，Wallinder IO，Leygraf C.Metal release rate from AISI 316L stainless steel and pure Fe，Cr and Ni into a synthetic biological medium——a comparison［J］.J Environ Monit，2008，10（9）：1092-1098.

［4］Talha M，Behera CK，Sinha OP.A review on nickel-free nitrogen containing austenitic stainless steels for biomedical applications［J］.Mater Sci Eng C Mater Biol Appl，2013，33（7）：3563-3575.

［5］Kim NH，Kang PM.Apoptosis in cardiovascular diseases：mechanism and clinical implications［J］.Korean Circ，2010，40（7）：299-305.

［6］Koster R，Vieluf D，Kiehn M.Nickel and molybdenum contact allergies in patients with coronary stents［J］.Lancet，2000，356（9245）：1895-1897.

［7］Saito T，Hokimoto S，Oshima S.Metal allergic reaction in chronic refractory in-stent restenosis［J］.Cadiovasc Revasc Med，2009，10（1）：17-22.

［8］D’Anto V，Valletta R，Amato M.Effect of nickel chloride on cell profliferation［J］.Open Dent J，2012，6：177-181.

［9］Gillies LA，Kuwana T.Apoptosis regulation at the mitochondrial outer membrane［J］.J Cell Biochem，2014，115（4）：632-640.

［10］Bai L，Wang S.Targeting apoptosis pathways for new cancer therapeutics［J］.Annu Rev Med，2014，65：139-155.

［11］Mitra CK，Korla K.Functional，structural，and sequence studies of microRNA［J］.Methods Mol Biol，2014，1107：189-206.

（編輯 王又冬）

MechanismsofNickel-free Stainless SteelInduced Apoptosisin Vascular EndothelialCells

TANGSu-ming1，ZHOU Xiao-hang1，LILi-ming2，GUANYi-fu1
（1.Department of Biochemistry and Molecular Biology，College of Basic Medical Science，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Insititue of Biotechnology，College ofLife and Health Science，NortheastUniversity，Shenyang 110819，China）

ObjectiveTo investigate the effects ofhigh nitrogen nickel-free austenitic stainless steel（HNNF SS）on the apoptosisinduction ofvascular endothelial cells and develop a novel biomaterial for circumventing the in-stent restenosis.MethodsHuman umbilical vein endothelial cells（HUVECs）were growed on the HNNF SS and general 316L stainless steel（316L SS）.Annexin V-FITC and Propidium Iodide were employed to detect the apoptosis by flow cytometric analysis.The expression of apoptosis-related genes and microRNA were also examined by quantitative realtime PCR（qRT-PCR）.ResultsFlow cytometry analysis revealed that 316L SS could activate the cellular apoptosis more efficiently than HNNF SS（P＜0.05）.Atthe molecularlevel，qRT-PCR results showed thatthe cellapoptosis related genes were overexpressed on 316L SS（P＜0.05），including Fas，Caspase-3，and Caspase-8.The overexpression of miR-133a，186，210，34a and 124 was also observed in HUVECs growing on the 316L SS and HNNF SS materials（P＜0.05）.ConclusionThe mechanism of 316L SS triggering cell apoptosis might be related to the releasing nickelinducing cellapoptosis via Fas-Caspase-8-Caspase-3 exogenous pathway，which is modulated by altered microRNAexpression；the RT-PCR results also showed the expression variation of related genes and miRNA.Our results suggested that HNNF SS is better than the 316L SS material in the aspectofavoiding cellapoptosisand circumventing the in-stentrestenosis.

stainless steel frame；vascular endothelium；apoptosis；microRNA

R329

A

0258-4646（2014）06-0481-04

國家自然科學(xué)基金（31070705）

唐蘇銘（1987-），男，助理實(shí)驗(yàn)師，本科.

關(guān)一夫，E-mail：yfguan@mail.cmu.edu.cn

2014-03-06

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：