翟晶晶 王明永 凌明智 王凡平 郭 康 宋士軍 段巨洪 張 娜 李夢杰 左萌潔 趙雯瑕

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，新鄉(xiāng) 453003)

甘露聚糖結(jié)合凝集素(Mannan-binding lectin，MBL)是由肝細(xì)胞分泌的血漿蛋白，為天然免疫系統(tǒng)中的關(guān)鍵分子［1］，除了通過激活補(bǔ)體促進(jìn)對(duì)C.albicans 的調(diào)理吞噬外，近年來研究發(fā)現(xiàn)MBL 在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答中也發(fā)揮著重要作用［2-10］。白假絲酵母菌(Candida albicans，C.albicans，白色念珠菌)是臨床上最常見的致病性真菌，正常情況下C.albicans 是正常菌群，存在于人的皮膚和口腔、上呼吸道、陰道及腸道黏膜，當(dāng)免疫功能受到損害或正常菌群失調(diào)時(shí)，C.albicans 即成為條件致病菌，引起各種念珠菌病。C.albicans 由酵母相(Yeast form，Y)向菌絲相(Hyphal form，H)轉(zhuǎn)化是其感染性轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因素，故其菌相轉(zhuǎn)變與引起機(jī)體感染密切相關(guān)［11］。影響C.albicans 相態(tài)轉(zhuǎn)化的理化因素很多，血清、37℃、中性pH 值、乙酰葡萄糖胺、營養(yǎng)缺乏、脯氨酸等因素可以促進(jìn)C.albicans 從酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)化。但至今沒有免疫分子調(diào)節(jié)C.albicans 相態(tài)轉(zhuǎn)化的相關(guān)報(bào)道。

本研究選擇天然免疫分子MBL 為研究對(duì)象，首先從形態(tài)學(xué)分析MBL 對(duì)C.albicans 相態(tài)轉(zhuǎn)化的影響;又進(jìn)一步從基因水平分析MBL 調(diào)控C.albicans相態(tài)轉(zhuǎn)化的機(jī)制，旨在進(jìn)一步闡述 MBL 抗C.albicans 感染的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 人血漿天然MBL 按文獻(xiàn)［12］制備。牛血清白蛋白(BSA，北京鼎國公司)，F(xiàn)ITC(Sigma公司)，瓊脂糖(Agarose，西班牙Biowest)，胰蛋白胨(Tryptone powder，BIO BASIC)，酵母提取物(Yeast extract，Oxoid)，RPMI1640 購自Gibco 公司，HEPES購自Solarbio 公司，Yeast RNAiso Kit、PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ、6 ×Loading Buffer 均購自TaKaRa 公司。結(jié)合緩沖液:20 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L CaCl2、2 mmol/L MgCl2、5 g/L BSA、1 g/L 疊氮鈉。其他化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純產(chǎn)品，倒置相差顯微鏡為Nikon(TS100)，核酸蛋白分析儀(Eppendorf)，F(xiàn)ACS Calibur 流式細(xì)胞儀為美國BD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 C.albicans 的培養(yǎng) 取C.albicans 標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 10231，四區(qū)劃線于酵母膏胨葡萄糖(Yeast extract peptone dextrose，YEPD)瓊脂培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)16 h，傳代一次，將16 h 傳代培養(yǎng)物懸浮于RPMI1640 培養(yǎng)基中，調(diào)整菌液濃度為5 ×107個(gè)/ml，設(shè)MBL 處理組和對(duì)照組，MBL 處理組加100 μl 過濾除菌的MBL(10 mg/L)，對(duì)照組加100 μl 無菌生理鹽水，37℃200 r/min 震蕩培養(yǎng);在不同時(shí)間點(diǎn)取培養(yǎng)物于倒置相差顯微鏡下觀察C.albicans 菌絲形成情況，余下菌懸液用于提取總RNA。

1.2.2 制備FITC-MBL 根據(jù)文獻(xiàn)［13］，采用透析法，以FITC 標(biāo)記MBL，標(biāo)記產(chǎn)物FITC-MBL 的F/P比值為2.4。

1.2.3 結(jié)合試驗(yàn) 將C.albicans 用結(jié)合緩沖液(調(diào)整Ca2+濃度分別為1 mmol/L、5 mmol/L，或者用5 mmol/L EDTA 代替CaCl2)重懸并調(diào)整菌液濃度為5 ×109個(gè)/L，于200 μl 菌懸液中加入FITCMBL，37℃避光反應(yīng)30 min。選擇人血漿MBL 生理濃度的上限10 mg/L 作為實(shí)驗(yàn)中MBL 用量。PBS 洗滌3 次，F(xiàn)ACS 分析。以加未標(biāo)記FITC 的MBL 為陰性對(duì)照。

1.2.4 RT-PCR 分析C.albicans HWP1、DDR48 mRNA 的表達(dá) C.albicans 總RNA 的制備:分別取上述MBL 處理組和對(duì)照組C.albicans 1 ×107個(gè)，用無菌PBS 洗1 次，按Yeast RNAiso Kit 說明書操作提取總RNA。以1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，用核酸蛋白分析儀測定RNA 濃度及A260 nm/A280 nm 比值。統(tǒng)一調(diào)整總RNA 濃度為0.20 mg/ml，立即反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR 引物的設(shè)計(jì)與合成:參考文獻(xiàn)［14］并經(jīng)Primer premier 5.0 軟件分析，由上海生工公司合成HWP1、DDR48 和β-actin 等3 對(duì)特異性引物(序列見表1)。β-actin 作為內(nèi)參照。cDNA 合成:分別取對(duì)照組和MBL 處理組C.albicans總RNA 各1 μg、5 ×Prime Script?Buffer 4 μl、Prime-Script?RT Enzyme Mix I 1 μl、Oligo dT Primer (50 μmol/L)1 μl 和Random 6 mers (100 μmol/L)1 μl，加RNase Free H2O 至總反應(yīng)體積20 μl。37℃反應(yīng)15 min 合成cDNA 第一鏈，85℃5 s 滅活反轉(zhuǎn)錄酶終止反應(yīng)，4℃ 5 min 復(fù)性。PCR:反應(yīng)體系為:SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(2 ×)10 μl，上、下游引物各0.8 μl (10 μmol/L)，模板cDNA 2 μl，加滅菌蒸餾水至總反應(yīng)體積20 μl。PCR 反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃延伸30 s，循環(huán)40次。取 各 PCR 擴(kuò) 增 產(chǎn) 物 5 μl 于 1%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，紫外燈下觀察、拍照，并用凝膠成像儀分析DNA 片段的灰度值。

表1 引物序列及RT-PCR 產(chǎn)物的大小Tab.1 Primer sequence and sizes of RT-PCR products

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS17.0 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析方法(one-way ANOVA)，P ＜0.05 時(shí)具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 MBL 抑制C.albicans 酵母相(Y)向菌絲相(H)轉(zhuǎn)化 取MBL 處理組與對(duì)照組C.albicans 培養(yǎng)物于400 × 倒置相差顯微鏡下觀察，與對(duì)照組相比，MBL處理組C.albicans在2、4h時(shí)，菌絲生長明顯被抑制，至8 h 時(shí)，兩組菌絲生長基本一致，無明顯差異(見圖1)。

圖1 MBL 抑制C.albicans 酵母相(Y)向菌絲相(H)轉(zhuǎn)化Fig.1 MBL inhibits C.albicans Yeast form transform to Hyphal form

圖2 MBL 以鈣離子依賴形式結(jié)合C.albicansFig.2 Ca2+-dependent binding underlying interaction of MBL with C.albicans cells

2.2 MBL 以Ca2+依賴方式結(jié)合C.albicans FACS分析表明，MBL 在無Ca2+、或含EDTA 的結(jié)合緩沖液中幾乎不與酵母相、菌絲相C.albicans 結(jié)合，而在分別含1 mmol/L、5 mmol/L Ca2+的結(jié)合緩沖液中，MBL 與酵母相、菌絲相C.albicans 的結(jié)合逐漸增強(qiáng)，呈Ca2+濃度依賴關(guān)系(見圖2)。當(dāng)加入Ca2+離子螯合劑EDTA 以后，MBL 的結(jié)合作用幾乎消失(見圖2)。

2.3 MBL 對(duì)C.albicans HWP1、DDR48 mRNA 表達(dá)的影響 用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA 顯示28S 和18S rRNA 兩條清晰帶，核酸蛋白分析儀測得RNA 樣品A260 nm/A280 nm 比值均大于1.8，表明提取的總RNA 均具有較高的純度和完整性。RT-PCR 結(jié)果(見圖3)顯示:PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物為預(yù)期大小;與對(duì)照組相比，加MBL 處理2、4 h，C.albicans HWP1 mRNA 表達(dá)明顯減少，于相應(yīng)位置泳帶減弱，MBL 處理8 h，HWP1 mRNA 表達(dá)較多，與對(duì)照組無明顯差異;而在各時(shí)間段，MBL 處理組與對(duì)照組DDR48 mRNA 表達(dá)無明顯差異，由此可見MBL 在早期抑制C.albicans 相態(tài)轉(zhuǎn)化基因HWP1 mRNA 的表達(dá)。凝膠成像儀DNA 片段灰度分析亦顯示:MBL 處理2、4 h 時(shí)，C.albicans HWP1的RT-PCR 擴(kuò)增片段灰度明顯弱于相應(yīng)對(duì)照組，MBL 處理8 h，灰度與對(duì)照組相當(dāng)，無明顯差異;在各時(shí)間段，MBL 處理組和對(duì)照組C.albicans DDR48的RT-PCR 擴(kuò)增片段灰度均無明顯差異(見圖4)。

圖3 不同實(shí)驗(yàn)組C.albicans HWP1、DDR48 mRNA 的表達(dá)Fig.3 mRNA expressions of C.albicans HWP1，DDR48 in different experiment groups

圖4 不同實(shí)驗(yàn)組C.albicans HWP1、DDR48 DNA 擴(kuò)增片段灰度值Fig.4 Raw vol.of C.albicans HWP1，DDR48 DNA fragments in different experiment groups

3 討論

C.albicans 是臨床上最常見的致病性真菌，生長環(huán)境改變時(shí)C.albicans 可由酵母相轉(zhuǎn)變?yōu)榫z相，被稱為二態(tài)性真菌。酵母相C.albicans 通常不具有感染性，轉(zhuǎn)變?yōu)榫z相就具備了較強(qiáng)的感染性，酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)化是C.albicans 適應(yīng)不同生長環(huán)境的重要轉(zhuǎn)換方式，也是其感染性轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因素。因此，抑制C.albicans 酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)化是控制C.albicans 感染較好的切入點(diǎn)，免疫系統(tǒng)對(duì)抗C.albicans 感染有重要作用，但免疫分子對(duì)C.albicans 相態(tài)轉(zhuǎn)化是否有調(diào)節(jié)作用尚未見報(bào)道。

MBL 是一種急性期蛋白，在C.albicans 感染早期由肝細(xì)胞合成并分泌，在正常人血清中濃度為0.01～10 mg/L，應(yīng)激狀態(tài)下MBL 水平可大幅升高［15］，在抗感染免疫中起重要作用。本課題組前期一直在研究MBL 在抗C.albicans 感染免疫中的作用，發(fā)現(xiàn)MBL 對(duì)C.albicans 誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)有抑制作用［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，C.albicans 培養(yǎng)過程中加入MBL，在早期(4 h 以內(nèi))可明顯抑制C.albicans 菌絲相的生長，但這種抑制作用并非完全阻止酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)化，隨著時(shí)間延長這種抑制作用逐步減弱，因此推測，在C.albicans 感染早期，機(jī)體MBL 能夠通過抑制C.albicans 菌絲的形成，起抗C.albicans 感染的作用。

為了進(jìn)一步研究MBL 抑制C.albicans 酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)化的機(jī)制，我們又分析了MBL 與C.albicans 的結(jié)合情況。FACS 分析顯示，MBL 能夠與酵母相和菌絲相C.albicans 結(jié)合，且這種結(jié)合與Ca2+濃度呈依賴關(guān)系，由此推測，酵母相和菌絲相C.albicans 表面均存在Ca2+依賴的MBL 結(jié)合配體。

HWP1 是編碼C.albicans 菌絲胞壁蛋白HWP1的基因，研究表明其編碼一種膜外甘露糖可與細(xì)胞壁β-甘露糖以共價(jià)鍵結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)菌絲形成［16］。RT-PCR 分析發(fā)現(xiàn):與對(duì)照組相比，MBL 處理早期(4 h 以內(nèi))，HWP1 基因表達(dá)量明顯減少(P ＜0.05)，提示MBL 在早期抑制C.albicans 菌絲生長，可能與抑制HWP1 基因表達(dá)有關(guān)。但這種作用是MBL 特異性的通過HWP1 調(diào)節(jié)C.albicans 相態(tài)轉(zhuǎn)化，還是與其他因素共同作用的?尚需進(jìn)一步深入研究。

DDR48 編碼的Ddr48 蛋白是一種損傷反應(yīng)蛋白，被認(rèn)為是C.albicans 的必需蛋白，在C.albicans包膜和菌絲形成過程中表達(dá)均增加［17］;并被認(rèn)為與DNA 破壞相關(guān)，環(huán)境溫度、鈣離子、滲透壓等升高時(shí)其表達(dá)也增多［18］。與對(duì)照組比較，MBL 處理組DDR48 表達(dá)無顯著性差異(P ＞0.05)，提示MBL 抑制C.albicans 菌絲生長不是通過調(diào)控DDR48 基因的表達(dá)發(fā)揮作用的。

綜上所述，MBL 能夠與C.albicans 以Ca2+依賴方式結(jié)合，在C.albicans 感染早期，通過減弱調(diào)控基因HWP1 的表達(dá)，從而抑制C.albicans 酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)化。本研究進(jìn)一步豐富了 MBL 在抗C.albicans 感染中的調(diào)節(jié)作用。

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