張翔凌 王冬梅 梁格為 李 毅 吳 穗 董偉群

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院輸血科，昆明 650032)

現(xiàn)代許多臨床研究已表明，人類血小板抗原(HPA)所導(dǎo)致的血小板同種免疫與新生兒同種免疫性血小板減少癥(NATP)、血小板輸注無效(PRT)、輸血后紫癜(PTP)、移植相關(guān)血小板減少癥、動(dòng)脈血栓性疾病等相關(guān)［1，2］。而不同人群中的HPA 抗原的分布頻率是與獲得HPA 免疫機(jī)會(huì)正相關(guān)的，本文選擇云南省獨(dú)有的阿昌族為研究對(duì)象，與云南漢族為對(duì)照，采用目前HPA 基因分型最常用的PCR-SSP 技術(shù)，對(duì)不同人群中HPA 基因及基因型頻率的分布情況作對(duì)比分析，探討血小板抗原多態(tài)性與地區(qū)、民族的關(guān)系，建立云南少數(shù)民族地區(qū)的血液資源的血小板基因資料庫，同時(shí)有助于探討少數(shù)民族的起源、遺傳、遷移及為法醫(yī)個(gè)體識(shí)別提供數(shù)據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 2011～2012 年，采集分布在滇南地區(qū)的阿昌族健康人群139 例，昆明地區(qū)健康漢族人群150 例，所有樣本追溯三代無與其他民族通婚史，彼此間無血緣關(guān)系，對(duì)所有選取對(duì)象均履行倫理知情告知，并自愿參加。

1.2 標(biāo)本 每人抽取EDTA-K2 抗凝靜脈血2～3 ml，-80℃凍存待檢。

1.3 儀器與試劑 PCR 擴(kuò)增儀、水平電泳儀:美國Bio-Rad 公司，凝膠成像系統(tǒng):Bio-Rad 公司Gel Doc EQ 凝膠成像系統(tǒng)。血小板抗原基因分型試劑盒:長春博德生物技術(shù)有限公司。

1.4 DNA 提取 采用碘化鉀法，用紫外分光光度計(jì)測定提取的基因組DNA 的紫外吸收峰，分別在波長260 nm、280 nm 測定吸光度，用公式計(jì)算DNA 濃度、純度。統(tǒng)一稀釋成1 μg/μl 于-20℃儲(chǔ)存。

1.5 HPA 基因分型試驗(yàn) 包括PCR 引物混合物(序列特異性引物0.4 μmol/L，內(nèi)對(duì)照引物0.4 μmol/L)、10 ×PCR Buffer 5 μl、dNTP 0.2 mmol/L，Taq 酶0.75 U 和基因組DNA 1 μg，在同一條件下對(duì)HPA1～17 系統(tǒng)同時(shí)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)條件:94℃、9 min;94℃、1 min;61℃、1 min;72℃、1 min;共35 個(gè)循環(huán);最后72℃，10 min。

1.6 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測 PCR 產(chǎn)物10 μl 在2%瓊脂糖凝膠(含0.5 mg/L 溴化乙錠)中電泳，80 mV 電壓，30 min 結(jié)束電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SAS9.3 統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。不同人群間基因頻率的比較進(jìn)行χ2檢驗(yàn)(精確概率法)，基因型之間的比較采用χ2檢驗(yàn)的多個(gè)構(gòu)成比的比較。以P ＜0.05 為有差異，P ＜0.01 為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 阿昌族HPA1～17 系統(tǒng)基因檢測及統(tǒng)計(jì)結(jié)果 139 例阿昌族人群HPA1-17 系統(tǒng)基因檢測結(jié)果見表1，圖1 為阿昌族人群HPA1～17 系統(tǒng)基因分型的凝膠成像圖:阿昌族人群中HPA-7、HPA9～14，HPA-16 抗原系統(tǒng)的基因型均為aa，未檢測出相應(yīng)的等位基因HPA-b;HPA-1，2，4，5，6，8，17 抗原系統(tǒng)的基因型以aa 居多，HPA-3，15 具有較高的雜合度，HPA-3aa、3ab、3bb 的基因型頻率分別為31.65%、48.2%、20.15%，HPA-15aa、15ab、15bb 的基因型頻率分別為35.25%、36.69%、28.06%。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，阿昌族人群樣本的基因檢測結(jié)果符合H-W 遺傳平衡定律。

2.2 漢族組人群HPA1～17 系統(tǒng)基因和基因型頻率分布 150 例漢族人群中HPA7～14，HPA16，17 抗原系統(tǒng)的基因型均為aa，未檢測出相應(yīng)的等位基因HPA-b;HPA1，2，4，5，6 抗原系統(tǒng)的基因型以aa 居多，HPA3，15 具有較高的相同的雜合度，其aa、ab、bb 的基因型頻率分別為34%、46.67%、19.33%，結(jié)果見表2。

表1 139 例阿昌族組人群HPA1～17 系統(tǒng)基因和基因型頻率分布(n=139)Tab.1 Gene and genotype frequencies of HPA1 -17 in Achang population(n=139)

表2 150 例漢族人群HPA1～17 系統(tǒng)基因和基因型頻率分布(n=150)Tab.2 Gene and genotype frequencies of HPA1 -17 in Han population(n=150)

圖1 阿昌族122 號(hào)樣本凝膠成像圖Fig.1 HPA Gel doemnent of sample in Achang population

2.3 阿昌族與漢族人群間基因頻率的比較 兩個(gè)民族的HPA-7，HPA9～13，HPA-14，16 系統(tǒng)的基因型均為aa，均未檢測出相應(yīng)的等位基因HPA-b;兩個(gè)民族的HPA-3 與HPA-15 均具有較高的多態(tài)性;與對(duì)照組(漢族)人群比較，阿昌族HPA-1a 系統(tǒng)有差異(P ＜0.05)，結(jié)果見表3。

表3 阿昌族與漢族人群間基因頻率的比較表Tab.3 Comparison of gene frequencies between Achang population and Han population

3 討論

現(xiàn)代許多臨床研究已表明，人類血小板抗原(HPA)所導(dǎo)致的血小板同種免疫與新生兒同種免疫性血小板減少癥(NATP)、血小板輸注無效(PRT)、輸血后紫癜(PTP)、移植相關(guān)血小板減少癥、動(dòng)脈血栓性疾病等相關(guān)、對(duì)此類疾病的診斷、預(yù)防和治療均需以血小板同種抗原的基因分型為基礎(chǔ)。

云南省匯集了全國最多的少數(shù)民族，少數(shù)民族間進(jìn)行血液輸注的可能性非常大，故非常有必要進(jìn)行其他少數(shù)民族HPA 基因多態(tài)性的研究，特別近年來部分少數(shù)民族人口數(shù)量下降，對(duì)于保存其民族遺傳學(xué)和人類學(xué)資料也具有重要意義;目前國內(nèi)外對(duì)HPA 研究可見報(bào)道，其中，國內(nèi)目前對(duì)漢族人群的HPA 研究較多［3，4］，少數(shù)民族HPA研究報(bào)道甚少［5，6］，而云南省少數(shù)民族血小板同種抗原的研究尚未見報(bào)道［7］。

本文以云南省特有的少數(shù)民族阿昌族為研究對(duì)象，對(duì)不同人群中HPA 基因及基因型頻率的分布情況作對(duì)比分析，探討血小板抗原多態(tài)性與地區(qū)、民族的關(guān)系，研究結(jié)果顯示:從HPA 基因分型結(jié)果可看出(見表1～3)，云南地區(qū)阿昌族健康人群中的HPA1～17 基因頻率與同地區(qū)的漢族接近，也呈現(xiàn)各自自身的特點(diǎn)。兩個(gè)民族的HPA-7、HPA9～13、HPA-14，16 系統(tǒng)的基因型均為aa，均未檢測出相應(yīng)的等位基因HPA-b;兩個(gè)民族群樣本的HPA1～6、HPA-8，13，15，17 系統(tǒng)中a 的基因頻率 均大于50%;阿昌族與漢族人群的HPA-3 與HPA-15 系統(tǒng)均具有較高的多態(tài)性，明顯較其他系統(tǒng)具有較高遺傳多態(tài)性，通過對(duì)MP 值的計(jì)算發(fā)現(xiàn)，HPA-3、15 系統(tǒng)易發(fā)生因?yàn)殄e(cuò)配輸注產(chǎn)生同種免疫反應(yīng)。阿昌族HPA-1a 基因頻率與漢族人群相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，為提高血小板輸注的安全性和有效性，應(yīng)高度重視HPA 同種免疫作用，同時(shí)關(guān)注是否存在不同民族之間血小板抗原基因差異而導(dǎo)致的免疫作用。根據(jù)本次調(diào)查的HPA 基因多態(tài)性頻率，可以預(yù)測阿昌族人群發(fā)生血小板同種免疫的風(fēng)險(xiǎn)，在臨床上，HPA-1a、HPA-3 與HPA-15 為具有重要意義的血小板抗原系統(tǒng)。對(duì)少數(shù)民族進(jìn)行HPA 分型，可對(duì)預(yù)防和診斷由HPA 同種免疫所造成的疾病，建立少數(shù)民族地區(qū)血小板供者庫提供依據(jù)。HPA 作為人類遺傳多態(tài)性標(biāo)記，還可應(yīng)用于法醫(yī)個(gè)體識(shí)別，人類進(jìn)化與遷徙，以及某些疾病相關(guān)性的研究。

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