張憶雄 胡 燕 郭萌萌 朱順飛 陶弋婧 趙娟娟 周 涯 鄭 靜 徐 林

(遵義醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室暨貴州省免疫學(xué)研究生教育創(chuàng)新基地，遵義 563000)

腸系膜淋巴結(jié)(Mesenteric lymph nodes，MLNs)是腸相關(guān)淋巴組織的重要組成部分，也是腸道局部免疫應(yīng)答誘導(dǎo)的初始部位。腸系膜淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞的比例和數(shù)量可反映局部黏膜免疫防御功能的完善程度，而其淋巴細(xì)胞組成異常與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)［1］。如腸系膜淋巴結(jié)Th1/Th17 細(xì)胞比例異常將導(dǎo)致炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease，IBD)等自身免疫性疾病的發(fā)生［2］。

MicroRNA-126(miR-126)是miRNAs 家族中重要的一員，位于EGFL7 基因7 號(hào)內(nèi)含子中，其在血管和心臟、肺等組織器官的內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)［3］。新近大量研究報(bào)道m(xù)iR-126 與免疫細(xì)胞的功能相關(guān)。Okuyama 等［4］發(fā)現(xiàn)miR-126 可調(diào)控B 細(xì)胞前體細(xì)胞的功能。Agudo 等［5］報(bào)道m(xù)iR-126 可通過(guò)VEGFR2 軸調(diào)控漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cells，pDCs)的功能，參與病毒等微生物引發(fā)的固有免疫應(yīng)答。此外，我們課題組新近也發(fā)現(xiàn)miR-126 可通過(guò)PI3K/AKT 調(diào)控CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞的外周誘導(dǎo)［6］，提示其在機(jī)體免疫應(yīng)答中具有重要調(diào)控作用。然而，miR-126 與腸系膜淋巴結(jié)免疫細(xì)胞組成的相關(guān)關(guān)系至今仍未有研究報(bào)道。本研究中擬利用miR-126 基因敲減小鼠模型，初步探討miR-126 敲減后對(duì)腸系膜淋巴結(jié)T 及B 淋巴細(xì)胞比例的影響，以期為深入探討miR-126 在固有免疫應(yīng)答中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級(jí)雌性FVB 小鼠和miR-126KD 小鼠(廣州賽業(yè)生物科技有限公司);蘇木精-伊紅(HE)染色液(泰康醫(yī)療);流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter);熒光顯微鏡(Olympus);R-Phycoerythrin(PE)anti-mouse CD19，R-Phycoerythrin (PE)antimouse CD3、R-Phycoerythrin (PE)anti-mouse CD4 及Allophycocyanin (APC) anti-mouse CD8 (Ebioscience)。

1.2 方法

1.2.1 miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結(jié)重量和細(xì)胞數(shù)目的檢測(cè) 取出miR-126KD 小鼠和WT 小鼠腸系膜淋巴結(jié)，稱取重量后制成石蠟切片備用;另一部分用玻片的糙面輕輕研磨成單細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.2.2 HE 染色檢測(cè)腸系膜淋巴結(jié)的形態(tài)學(xué)改變 石蠟切片HE 染色，顯微鏡下觀察腸系膜淋巴結(jié)的病理形態(tài)學(xué)改變。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)(FACS)檢測(cè)腸系膜淋巴結(jié)淋巴細(xì)胞比例的變化 取出miR-126KD 小鼠和WT 小鼠腸系膜淋巴結(jié)后，置于冰上，用玻片的糙面輕輕研磨成單細(xì)胞懸液，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，1 200 r/min 10 min 離心，棄掉上清液，分別加入CD19-PE、CD3-PE、CD4-PE 和CD8-APC 熒光標(biāo)記抗體各1 μl，4℃避光孵育30 min，PBS 洗滌2 遍，F(xiàn)ACS檢測(cè)。

1.2.4 采用GraphPad PrismTM統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以±s 表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本資料的t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結(jié)的重量和細(xì)胞總數(shù)的變化 WT 小鼠和miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結(jié)形態(tài)及大小如圖1A 所示，與WT 小鼠組相比，miR-126KD 組的淋巴結(jié)體積明顯增大;miR-126KD組淋巴結(jié)重量也顯著增加，且細(xì)胞總數(shù)明顯增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖1B、C，P ＜0.05)。

2.2 miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結(jié)病理形態(tài)學(xué)的改變 HE 染色結(jié)果如圖2 所示，低倍鏡下可見(jiàn)miR-126KD 組淺層皮質(zhì)區(qū)淋巴小結(jié)增生(圖2A、B)，在高倍鏡下還可見(jiàn)副皮質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞明顯增加(圖2E、F)。

2.3 miR-126KD 小鼠中腸系膜淋巴結(jié)CD19+B細(xì)胞及CD3+T 細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)變化 FACS 檢測(cè)結(jié)果如圖3 所示，WT 小鼠和miR-126KD 小鼠MLNs 中CD19+B 細(xì)胞及CD3+T 細(xì)胞百分率均無(wú)明顯變化。

圖1 miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結(jié)重量和細(xì)胞總數(shù)的變化Fig.1 Change on weight and total cells number in miR-126KD mice

圖2 miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結(jié)病理形態(tài)學(xué)觀察(HE 染色)Fig.2 Pathologic morphology of mesenteric lymph nodes in miR-126KD mice (HE staining)

圖3 WT 小鼠和miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結(jié)CD19 +B 細(xì)胞及CD3 + T 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的比較Fig.3 Comparison of CD19 + B cells and CD3 + T cells in WT mice and miR-126KD mice

圖4 WT 小鼠和miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結(jié)CD4 + T細(xì)胞及CD8 + T 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)的變化Fig.4 Change on proportion of CD4 + T cells and CD8 +T cells in WT mice and miR-126KD mice

圖5 WT 小鼠和miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結(jié)CD19 +B 細(xì)胞、CD4 + T 細(xì)胞和CD8 + T 細(xì)胞數(shù)量的變化Fig.5 Change on counts of CD19 + B cells，CD4 + T cells and CD8 + T cells in WT mice and miR-126KD mice

2.4 miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結(jié)CD4+T 細(xì)胞及CD8+T 細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)變化 我們進(jìn)一步用FACS 檢測(cè)CD4+T 細(xì)胞及CD8+T 細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。如圖4A 所示，該小鼠腸系膜淋巴結(jié)CD4+T 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)明顯減少，而CD8+T 細(xì)胞百分?jǐn)?shù)顯著增加(圖4B，P ＜0.05)。

2.5 miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結(jié)CD19+B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞數(shù)量的變化 最后，我們統(tǒng)計(jì)了miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結(jié)CD19+B細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞的數(shù)量。如圖5 所示，CD19+B 細(xì)胞和CD4+T 細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯差異，而CD8+T 細(xì)胞數(shù)量顯著增加(圖5，P ＜0.05)。

3 討論

微小RNA(microRNAs，miRNAs)是新近發(fā)現(xiàn)的一類由內(nèi)源基因編碼的參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的長(zhǎng)約19～22 個(gè)核苷酸的非編碼蛋白質(zhì)的單鏈RNA，其在胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等一系列生命進(jìn)程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用［7］。越來(lái)越多的研究表明，miRNAs 在調(diào)控免疫應(yīng)答的過(guò)程中起了重要的作用，并與免疫細(xì)胞的發(fā)育分化密切相關(guān)。如，新近Kang 等［8］報(bào)道m(xù)iR-17-92 家族可通過(guò)phIpp2 調(diào)控Tfh 細(xì)胞的分化;Gracias 等［9］則報(bào)道m(xù)iR-155 過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)CD8+T 細(xì)胞抗病毒應(yīng)答;此外，miR-10a 可通過(guò)Bcl-6 調(diào)控Th 細(xì)胞的可塑性分化［10］。然而，有關(guān)miRNAs 對(duì)黏膜免疫組織，如腸系膜淋巴結(jié)的作用的研究較少。

本研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)miR-126KD 小鼠的腸系膜淋巴結(jié)體積、重量和細(xì)胞總數(shù)均顯著增加。進(jìn)一步的檢測(cè)顯示miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結(jié)中，CD19+B 細(xì)胞、CD3+T 細(xì)胞比例無(wú)明顯變化，提示miR-126 敲減后不會(huì)顯著影響B(tài) 細(xì)胞和T 細(xì)胞的組成變化。然而，有意義的是，我們發(fā)現(xiàn)腸系膜淋巴結(jié)中CD8+T 細(xì)胞的比例和數(shù)量均顯著增加，而CD4+T 細(xì)胞的比例則明顯減少，數(shù)量無(wú)差異，提示miR-126 可能對(duì)不同T 淋巴細(xì)胞亞群的影響具有差異性。類似地，Rao 等［11］報(bào)道m(xù)iR-34a 敲減后，骨髓中B 淋巴細(xì)胞明顯增加;Henao 等［12］則報(bào)道，miR-181 敲除后，胸腺NKT 細(xì)胞比例顯著減少;此外，Kohlhaas 等［13］還報(bào)道，miR-155 敲除后，脾和腸系膜淋巴結(jié)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞比例和數(shù)量均顯著下降。這些研究提示，特定的miRNAs 分子可能在不同的免疫器官和免疫細(xì)胞中發(fā)揮了不同的調(diào)控作用。此外，我們還發(fā)現(xiàn)，miR-126KD 小鼠腸系膜淋巴結(jié)中淋巴小結(jié)增生，副皮質(zhì)區(qū)淋巴細(xì)胞增加，提示miR-126 還可能影響腸系膜淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞的分布，然而具體機(jī)制仍待闡明。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)miR-126 敲減后小鼠中腸系膜淋巴結(jié)T 淋巴細(xì)胞的變化，這為后續(xù)深入探討miR-126 在特定免疫器官和免疫細(xì)胞生物學(xué)功能中的作用提供了重要的前期實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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