蔣杞英 張 智 胡延忠 王明麗 馬遠(yuǎn)方 (鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，鄭州 450052)

熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(Heat shock transcription factor 1，Hsf1)是熱休克反應(yīng)的主要調(diào)控者。Hsf1 介導(dǎo)的熱休克反應(yīng)不僅保護(hù)細(xì)胞免受環(huán)境或細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激引起的損傷，而且涉及到對(duì)許多病理過(guò)程的調(diào)節(jié)，如炎癥和腫瘤的形成［1-4］。眾多研究表明，在調(diào)節(jié)腫瘤形成和發(fā)展的過(guò)程中，Hsf1 起了非常重要的作用，Hsf1 和其相關(guān)的下游靶蛋白(如HSPs)在大多數(shù)癌組織中是增高的［5-7］。

猴腎病毒40(Simian Virus 40，SV40)是雙鏈的DNA 腫瘤病毒，已經(jīng)從HIV 陽(yáng)性的非何杰金氏淋巴瘤病人組織中分離出來(lái)［8］。SV40 能夠表達(dá)兩種早期的癌蛋白小t 抗原(t-antigen，t-ag)和大T 抗原(Tantigen，T-ag)，T-ag 通常被用作轉(zhuǎn)基因腫瘤鼠模型和用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的體外研究［9］。致瘤作用主要是通過(guò)病毒性產(chǎn)物SV40 大T 抗原(T-antigen，T-ag)來(lái)完成的，能夠使很多種細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化［10，11］。

逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是80 年代才發(fā)展起來(lái)的一種高效基因轉(zhuǎn)移技術(shù)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能將目的基因高效整合于靶細(xì)胞染色體，具有高效、穩(wěn)定表達(dá)的特點(diǎn)，并且安全性很高，是最早成功應(yīng)用于臨床基因治療的載體［12，13］。

為了更好地研究Hsf1 基因的功能，本文將重建帶有鼠全長(zhǎng)Hsf1 基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pWZLBlast-Flag-Hsf1 和Hsf1 過(guò)表達(dá)的MEF/Hsf1-/-/Hsf1細(xì)胞系。MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞系的建立，為進(jìn)一步研究Hsf1 的功能提供細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 鼠抗兔HSF1 抗體(Sc-9144)(美國(guó)Santa Cruz 公司);鼠抗兔SV40T-ag 抗體(Sc-20800)(美國(guó)Santa C ruz 公司);鼠抗小鼠β-actin抗體(A0605)(美國(guó)Sigma 公司);羊抗兔IgG(ZB-2301)和羊抗小鼠IgG(ZB-2305)(北京中杉金橋公司)。

1.1.2 細(xì)胞系和質(zhì)粒 由湖南大學(xué)湘雅基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院肖獻(xiàn)忠教授饋贈(zèng)。(1)細(xì)胞系:①WT/MEF 細(xì)胞:應(yīng)用SV40T-抗原永生化從C57B16/V129 基因背景小鼠分離的野生型胚胎成纖維細(xì)胞。②MEF/Hsf1-/-細(xì)胞:應(yīng)用SV40T-抗原永生化從C57B16/V129 基因背景小鼠分離的Hsf1 敲除的胚胎成纖維細(xì)胞。③包裝病毒細(xì)胞293Phoenix:為小鼠的包裝細(xì)胞，在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染時(shí)用。(2)質(zhì)粒:pWZL-blast 質(zhì)粒和pWZL-blast-hsf1-flag1.9 質(zhì)粒。pWZL-blast-hsf1-flag1.9 質(zhì)粒將全長(zhǎng)Hsf1 的cDNA 與N末端的Flag-tag 連接，亞克隆到逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pWZL-blast，構(gòu)建pWZL-blast-flag-hsf1 重組體。

1.1.3 半定量RT-PCR 引物設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank報(bào)道的基因序列，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)并合成引物以擴(kuò)增SV40T-ag、p53 和Hsf1(β-actin作為內(nèi)參)，引物序列遞交上海生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將細(xì)胞放入含有100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。取生長(zhǎng)狀態(tài)好、處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 半定量RT-PCR 實(shí)驗(yàn) 主要是檢測(cè)Hsf1和SV40T-ag 基因在WT/MEF 細(xì)胞、MEF/Hsf1-/-細(xì)胞和MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞中mRNA 的表達(dá)水平。

1.2.2.1 細(xì)胞總RNA 的提取 (1)收集5 ×106個(gè)細(xì)胞，加入1 ml Trizol，顛倒混勻，使細(xì)胞充分裂解。(2)加入0.2 ml 提RNA 的專用氯仿，顛倒混勻，室溫放置10 min，13 000 r/min、4℃離心15 min。此時(shí)，溶液分三層，上層為水相含RNA，下層為有機(jī)相含DNA，中間層主要含蛋白質(zhì)。小心吸取上層水相，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻，-20℃放置20 min，沉淀RNA。(3)13 000 r/min，4℃離心15 min，棄上清。(4)加入75%RNA 專用酒精溶液(用DEPC 水配置)1 ml，顛倒混勻，13 000 r/min、4℃離心10 min，棄上清。重復(fù)洗滌沉淀一次。(5)底部白色沉淀即RNA，用吸水紙吸干。待沉淀中酒精溶液揮發(fā)完全，干燥后用無(wú)RNase DEPC 水20 μl 溶解RNA，即獲得細(xì)胞總RNA 溶液。(6)在提取的RNA 溶液中，分別加入DNA 裂解酶1 μl/100 μl，37℃，5 min 滅活。然后再加入1 μl RNA 酶抑制劑，立即進(jìn)行RNA 濃度的測(cè)定和反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，其余-80℃保存?zhèn)溆谩?7)RNA 濃度和純度的測(cè)定:取2 μl RNA 溶液溶于98 μl DEPC 水中，50 倍稀釋至100 μl，吹打混勻后用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)量OD260 和OD280的值。根據(jù)OD260 的值，計(jì)算RNA 的含量，而當(dāng)OD260=1 時(shí)，即相當(dāng)于40 μg/ml 的RNA。根據(jù)OD260/OD280 的值，估計(jì)RNA 的質(zhì)量。(8)RNA完整性的鑒定:用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定，電泳結(jié)束后將膠移至紫外燈下可以觀察到28S、18S 和5S 三條rRNA 帶型，28S 和18S 條帶比較亮，5S 條帶最不亮。通常以28S 和18S 顯色強(qiáng)度為2∶1，RNA 無(wú)降解，如果比值逆轉(zhuǎn)、升高或條帶模糊則表示有RNA 的降解。

1.2.2.2 cDNA 的合成 采用Promega 公司購(gòu)買(mǎi)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，取大約1 μg RNA 溶液進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20 μl。取Nuclease-free water 4.5 μl，MgCl24 μl，dNTP mi ×1 μl，RNase Inhibitor 0.5 μl，RT 酶1 μl 的混合物共計(jì)11 μl 加入EP 管中，置于冰上，然后再加入RNA 樣品4 μl(200 ng/ml)，Oligo primer 1 μl 和5 ×RT Buffer 4 μl。再25℃5 min，42℃1 h，70℃15 min，95℃10 min，4℃終止反應(yīng)。即可獲得WT/MEF 細(xì)胞和MEF/Hsf1-/-細(xì)胞的cDNA 溶液，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 用于半定量RT-PCR 引物設(shè)計(jì)Tab.1 Primers used for gene expression analysis by semiquantitative RT-PCR

1.2.2.3 PCR 實(shí)驗(yàn) 將上述獲得的cDNA 為模板，對(duì)內(nèi)參β-actin 基因片段進(jìn)行克隆，按以下體系進(jìn)行PCR 反應(yīng)。(1)將引物稀釋到1 μmol/L，上游和下游引物各吸取1 μl。(2)cDNA 稀釋到200 ng/ml。(3)PCR 反應(yīng)體系:cDNA 1 μl，10 × Buffer 2 μl，dNTP 2 μl，Tag 酶0.25 μl，dH2O213.25 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，總體積20 μl。(4)PCR 反應(yīng)條件:95℃5 min，95℃30 min，退火溫度(56.4℃，55℃)45 s，72℃40 s，30 個(gè)循環(huán)，72℃10 min，18℃終止反應(yīng)。(5)為了鑒定PCR 產(chǎn)物，采用2%瓊脂糖凝膠電泳，如果在399 bp 處出現(xiàn)β-actin 內(nèi)參條帶，證明cDNA 反轉(zhuǎn)錄成功，可以進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。(6)用上述反轉(zhuǎn)錄成功的cDNA 為模板克隆Hsf1 和SV40T-ag 基因片段。Hsf1 的退火溫度設(shè)計(jì)為56.4℃，SV40T-ag 的退火溫度為55℃。按上述總體積20 μl 的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR 反應(yīng)。2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR 產(chǎn)物，觀察在201 bp 和361 bp 處是否能擴(kuò)增出Hsf1 和SV40T-ag 特異性目的條帶，兩種細(xì)胞是否有差異?

1.2.3 pWZL-Blast-Flag-Hsf1 質(zhì)粒功能的鑒定 通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法，將構(gòu)建好的帶有Hsf1 全長(zhǎng)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pWZL-blast-flag-Hsf1 質(zhì)粒作為實(shí)驗(yàn)組，逆轉(zhuǎn)錄病毒空載體pWZL-blast 質(zhì)粒作為對(duì)照組，分別用脂質(zhì)體2000 轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogen)轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h～72 h。常規(guī)收細(xì)胞進(jìn)行Hsf1 的Western blot 檢測(cè)，以觀察Hsf1 蛋白的表達(dá)，從而進(jìn)一步判斷新轉(zhuǎn)入Hsf1 基因的功能。

1.2.4 MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞系的建立 將構(gòu)建好的帶有Hsf1 全長(zhǎng)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pWZLblast-flag-Hsf1，導(dǎo)入產(chǎn)生病毒的小鼠包裝細(xì)胞293Phoenix 內(nèi)，收集病毒上清，感染MEF/Hsf1-/-細(xì)胞，建立MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞系。具體實(shí)驗(yàn)步驟如下:(1)在20 cm2培養(yǎng)瓶正常培養(yǎng)包裝細(xì)胞293Phoenix，細(xì)胞密度達(dá)60%左右，細(xì)胞狀態(tài)好，轉(zhuǎn)染前一天換新鮮培養(yǎng)基DMEM。(2)轉(zhuǎn)染復(fù)合物的形成:分為兩組:①脂質(zhì)體2000 轉(zhuǎn)染試劑9 μl，pWZL-blast-flag-Hsf1 質(zhì)粒3 μg 和Pleco 質(zhì)粒1.5 μg 共轉(zhuǎn)染;②脂質(zhì)體2 000 轉(zhuǎn)染試劑9 μl;pWZL-blast 質(zhì)粒3 μg 和Pleco 質(zhì)粒1.5 μg 共轉(zhuǎn)染。上述脂質(zhì)體2 000 轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒分別用500 μl MEM 稀釋，充分混勻，但是不要?jiǎng)×艺鹗?。稀釋后的脂質(zhì)體2 000室溫靜置5 min，然后與稀釋后的質(zhì)?；旌衔锍浞只靹颍覝仂o置30 min，切記不要?jiǎng)×艺鹗帯?3)將上述制備的轉(zhuǎn)染復(fù)合物分別加入包裝細(xì)胞293Phoenix 的無(wú)血清、無(wú)雙抗培養(yǎng)基中，培養(yǎng)6 h 后換為全血清的DMEM 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h;換新的全血清DMEM 培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集含有病毒的培養(yǎng)上清。(4)將含有病毒液的培養(yǎng)基1 000 r/min，離心5 min，然后上清用0.45 mm 濾器過(guò)濾。在濾液中，加入2 μg/ml的Polybrene 試劑(美國(guó)Sigma 公司)后，直接加至生長(zhǎng)狀態(tài)好、密度50% 左右的MEF/Hsf1-/-細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，讓病毒液直接感染MEF/Hsf1-/-細(xì)胞。(5)感染24 h 后，加入3 μg/ml 的Blasticidine(美國(guó)Sigma 公司)殺傷3～4 d，沒(méi)有被病毒感染的MEF/Hsf1-/-細(xì)胞會(huì)被殺死。然后用2 μg/ml 的Blasticidine 作為維持量，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。這時(shí)，Hsf1 基因應(yīng)該轉(zhuǎn)入MEF/Hsf1-/-細(xì)胞中，MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞系的重建是否成功須進(jìn)一步鑒定。(6)MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞系的鑒定:通過(guò)Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Hsf1 蛋白的表達(dá)，以觀察Hsf1 是否成功轉(zhuǎn)入MEF/Hsf1-/-細(xì)胞及功能如何?

1.2.5 Western blot 實(shí)驗(yàn) 在WT/MEF 細(xì)胞、MEF/Hsf1-/-細(xì)胞和MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染Hsf1的293T 細(xì)胞中，分別加入蛋白裂解液，其中含有蛋白酶抑制劑(Protease inhibitor Cocktail)(美國(guó)Sigma公司)提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法測(cè)蛋白濃度(碧云天生物技術(shù)研究所)，制作蛋白樣品。通過(guò)10% SDSPAGE 電泳電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上，PVDF 膜先用含5%脫脂奶粉的TBST 溶液室溫下封閉1 h，加一抗(Hsf1、SV40T-ag 和β-actin)于含5% 脫脂奶粉的TBST 中孵育，4℃冰箱過(guò)夜。然后加入合適的二抗孵育1 h，用ECL 顯色液顯色、曝光X 光片、拍照和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 WT/MEF 細(xì)胞、MEF/Hsf1-/-細(xì) 胞和MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞的鑒定 通過(guò)半定量RT-PCR 實(shí)驗(yàn)，從轉(zhuǎn)錄水平觀察Hsf1 和SV40T-ag 基因在WT/MEF 細(xì)胞、MEF/Hsf1-/-細(xì)胞和MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞中mRNA 的表達(dá);通過(guò)Western blot 實(shí)驗(yàn)，從翻譯水平即蛋白質(zhì)水平觀察Hsf1 和SV40T-ag 蛋白在WT/MEF 細(xì)胞、MEF/Hsf1-/-細(xì)胞和MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞中的表達(dá)。

2.1.1 Hsf1 和SV40T-ag 基 因 在WT/MEF 和MEF/Hsf1-/-細(xì)胞中mRNA 的表達(dá) 從圖1A 可以看出，用Trizol 試劑提取細(xì)胞總RNA，通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳圖發(fā)現(xiàn)，從上到下出現(xiàn)28S、18S 和5S 三條清晰的rRNA 帶型，沒(méi)有拖帶現(xiàn)象。28S條帶最亮，大約是18S 條帶亮度的兩倍，5S 不太亮。圖中沒(méi)有出現(xiàn)基因組DNA 和蛋白質(zhì)污染情況，說(shuō)明提取RNA 的純度和完整性比較好，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

利用Promega 公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 立即反轉(zhuǎn)為cDNA，經(jīng)過(guò)PCR 擴(kuò)增后采用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。圖1B 顯示，WT/MEF 細(xì)胞、MEF/Hsf1-/-細(xì)胞和MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞在399 bp擴(kuò)增出基本一致的β-actin 特異性條帶，說(shuō)明通過(guò)反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)的cDNA 模板是成功的。

圖1C 結(jié)果顯示，Hsf1 基因在WT/MEF 細(xì)胞和MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞中擴(kuò)增出特異性目的條帶，而在MEF/Hsf1-/-細(xì)胞中沒(méi)有出現(xiàn)Hsf1 基因條帶。由于在WT/MEF 和MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞中Hsf1基因的mRNA 表達(dá)明顯，而在MEF/Hsf1-/-細(xì)胞中表達(dá)不明顯，這說(shuō)明MEF/Hsf1-/-細(xì)胞中Hsf1 基因的敲除是比較干凈的，同時(shí)也說(shuō)明通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)Hsf1 基因是成功的，新建MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞系是成功的。

圖1D 結(jié)果表明，SV40T-ag 基因在WT/MEF 細(xì)胞、MEF/Hsf1-/-細(xì)胞和MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞中均擴(kuò)增出特異性目的條帶，并且SV40T-ag 基因的mRNA 表達(dá)基本一致，這也說(shuō)明在轉(zhuǎn)錄水平上Hsf1 對(duì)SV40T-ag 的調(diào)控沒(méi)有影響。

2.1.2 Hsf1，SV40T-ag 蛋白在WT/MEF 和MEF/Hsf1-/-細(xì)胞中的表達(dá) 通過(guò)Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)WT/MEF 細(xì)胞和MEF/Hsf1-/-細(xì)胞中Hsf1 和SV40Tag 蛋白的表達(dá)。圖2 所示，Hsf1 蛋白在WT/MEF 細(xì)胞中的表達(dá)條帶非常明顯，而在MEF/Hsf1-/-細(xì)胞中的表達(dá)條帶幾乎看不到。說(shuō)明在MEF/Hsf1-/-細(xì)胞中Hsf1 的敲除是比較干凈的。另外，SV40T-ag 蛋白在MEF/Hsf1-/-細(xì)胞中的表達(dá)明顯比在WT/MEF 細(xì)胞中表達(dá)強(qiáng)。這也說(shuō)明Hsf1 下調(diào)SV40T-ag 蛋白的表達(dá)。

綜上所述，在基因水平和蛋白水平皆證明了MEF/Hsf1-/-細(xì)胞中Hsf1 基因的敲除是比較干凈的，可以進(jìn)行下面的實(shí)驗(yàn)。同時(shí)也證明了Hsf1 參與了SV40T-ag 蛋白表達(dá)的調(diào)控，主要在翻譯水平即蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。

2.2 pWZL-blast-Flag-Hsf1 質(zhì)粒的鑒定 將實(shí)驗(yàn)組pWZL-blast-flag-hsf1 質(zhì)粒和對(duì)照組pWZL-blast 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T 細(xì)胞，進(jìn)行Hsf1 的Western blot 檢測(cè)。

圖3 結(jié)果顯示，Hsf1 蛋白在轉(zhuǎn)染pWZL-blastflag-hsf1 質(zhì)粒的293T 細(xì)胞中的表達(dá)明顯比轉(zhuǎn)染pWZL-blast 質(zhì)粒強(qiáng)得多。說(shuō)明pWZL-blast-flag-hsf1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，同時(shí)也說(shuō)明pWZL-blast-flag-hsf1 質(zhì)粒是有功能和活性的，可以繼續(xù)下面的實(shí)驗(yàn)。

圖1 三種MEF 細(xì)胞中Hsf1 和SV40T-ag 基因的mRNA表達(dá)Fig.1 mRNA expression of Hsf1 and SV40T-ag gene in three MEF cell

圖2 Hsf1，SV40T-ag 蛋白在WT/MEF 和MEF/Hsf1-/-細(xì)胞中的表達(dá)Fig.2 Expression of Hsf1 and SV40T-ag proteins in WT/MEF and MEF/Hsf1-/-cell lines

圖3 Hsf1 蛋白在轉(zhuǎn)染pWZL-blast-flag-Hsf1 的293T 細(xì)胞中的表達(dá)Fig.3 Expression of Hsf1 protein were investigated in 293T cell of transfection with plasmid pWZLblast-flag-Hsf1

圖4 Hsf1，SV40T-ag 蛋白在三種MEF 細(xì)胞中的表達(dá)Fig.4 Expression of Hsf1 protein in three MEF cell lines

2.3 Hsf1，SV40T-ag 蛋白在三種MEF 細(xì)胞中的表達(dá) 通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將鼠Hsf1 全長(zhǎng)基因?qū)隡EF/Hsf1-/-細(xì)胞中，建立MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞系。為了鑒定Hsf1 基因是否轉(zhuǎn)入成功及功能如何?通過(guò)Western blot 檢測(cè)Hsf1 蛋白的表達(dá)，同時(shí)用MEF/Hsf1-/-細(xì)胞和WT/MEF 細(xì)胞作為對(duì)照。圖4 可以看出，Hsf1 在MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞表達(dá)條帶最強(qiáng)，WT/MEF 細(xì)胞表達(dá)也能看到清晰的條帶，而MEF/Hsf1-/-細(xì)胞不表達(dá)。這說(shuō)明Hsf1 基因已經(jīng)成功導(dǎo)入MEF/Hsf1-/-細(xì)胞，MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞系成功建立。MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞系的重建，有助于我們進(jìn)一步研究Hsf1 在SV40T-ag 誘導(dǎo)腫瘤形成中的作用。

另外，SV40T-ag 蛋白在MEF/Hsf1-/-細(xì)胞中的表達(dá)比WT/MEF 細(xì)胞和MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞強(qiáng)，在MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞中的表達(dá)最弱。這也提示我們Hsf1 參與了SV40T-ag 蛋白的表達(dá)調(diào)控。

3 討論

基因轉(zhuǎn)移是指用生物學(xué)或物理的手段，可將外源性基因?qū)胧荏w細(xì)胞，并使其表達(dá)的一種技術(shù)。逆轉(zhuǎn)錄病毒作為載體是一種高效的、新興起的表達(dá)系統(tǒng)，可將外源性基因安全、高效、穩(wěn)定地轉(zhuǎn)入哺乳類細(xì)胞中［13，14］。而外源基因與宿主細(xì)胞基因組整合后，就可隨著細(xì)胞的分裂傳給后代。當(dāng)包裝細(xì)胞被收獲后，就可以穩(wěn)定地得到含有目的載體的病毒顆粒。沒(méi)有經(jīng)過(guò)包裝的病毒屬于缺陷性病毒，并不具有完整的功能。只有經(jīng)過(guò)包裝細(xì)胞為其提供結(jié)構(gòu)蛋白組分時(shí)，才能包裝成功能完整的病毒顆粒。當(dāng)病毒顆粒感染靶細(xì)胞后，病毒顆粒是不能擴(kuò)增的，安全性也是很高的［12］。而與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染外源基因等傳統(tǒng)的介導(dǎo)方法相比，逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)系統(tǒng)可以大大提高獲得高效表達(dá)外源基因細(xì)胞系的幾率。

轉(zhuǎn)染細(xì)胞能否表達(dá)目的基因的表型，是基因轉(zhuǎn)移成功的關(guān)鍵。本文首先將本實(shí)驗(yàn)室保存的WT/MEF 細(xì)胞和MEF/Hsf1-/-細(xì)胞，進(jìn)行RT-PCR 和Western blot 實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了MEF/Hsf1-/-細(xì)胞系的Hsf1 敲除比較干凈。為了更好地研究Hsf1 在SV40T-ag 誘導(dǎo)腫瘤形成中的作用，應(yīng)用脂質(zhì)體2 000轉(zhuǎn)染試劑，將含有Hsf1 基因全長(zhǎng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pWZL-blast-flag-hsf1 轉(zhuǎn)染至能產(chǎn)生病毒的包裝細(xì)胞293Phoenix，將病毒上清直接進(jìn)行感染MEF/Hsf1-/-細(xì)胞，用3 μg/ml 抗生素Blasticidine 殺傷細(xì)胞3～4 d，這樣沒(méi)有轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞被殺死，轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞存活下來(lái)。以后細(xì)胞培養(yǎng)用2 μg/ml 抗生素Blasticidine 進(jìn)行維持，穩(wěn)定的MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞系就建好了。通過(guò)Western blot 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Hsf1 蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在新建細(xì)胞系Hsf1 的表達(dá)最強(qiáng)，而MEF/Hsf1-/-細(xì)胞的表達(dá)非常弱，說(shuō)明Hsf1 成功轉(zhuǎn)染，穩(wěn)定表達(dá)Hsf1 的MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞系成功建立，以進(jìn)行后續(xù)的Hsf1 基因功能的實(shí)驗(yàn)。

另外，我們也在基因水平和蛋白質(zhì)水平，分別通過(guò)RT-PCR 和Western blot 實(shí)驗(yàn)觀察了SV40T-ag 的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SV40T-ag 基因在WT/MEF 細(xì)胞和MEF/Hsf1-/-細(xì)胞中的表達(dá)沒(méi)有差異;SV40T-ag 蛋白在MEF/Hsf1-/-細(xì)胞表達(dá)強(qiáng)于WT/MEF 細(xì)胞和MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞。初步推測(cè)Hsf1 對(duì)SV40Tag 的調(diào)控作用不在基因水平，主要在翻譯水平即蛋白質(zhì)水平的表達(dá)。

總之，MEF/Hsf1-/-/Hsf1 細(xì)胞系的重建，有助于進(jìn)一步研究Hsf1 在SV40T-ag 誘導(dǎo)腫瘤形成中的作用提供實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。另外，本研究中還發(fā)現(xiàn)Hsf1 參與了SV40T-ag 蛋白的表達(dá)調(diào)控，尚需進(jìn)行更深入的探討。

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