姜麗亞 郭 震 戴景斌 趙炳波

益生菌治療成人特應(yīng)性皮炎療效評(píng)價(jià)

姜麗亞 郭 震 戴景斌 趙炳波

目的: 評(píng)價(jià)益生菌治療成人特應(yīng)性皮炎(AD)的療效。方法: 40例AD患者隨機(jī)分為A組和B組,A組給予抗組胺藥、0.05%地奈德乳膏及益生菌制劑,B組僅給予抗組胺藥和0.05%地奈德乳膏,兩組均治療12周。20名健康者作為對(duì)照。治療前、后及治療后2個(gè)月用SCORAD和VAS法進(jìn)行病情評(píng)分,并用PCR熒光定量法檢測(cè)受試者糞便中的細(xì)菌水平。結(jié)果: 治療結(jié)束時(shí),A組、B組評(píng)分較治療前均顯著降低(P＜0.01)；停藥2個(gè)月時(shí),A組評(píng)分仍低于治療前(P＜0.01),而此時(shí)B組評(píng)分與治療前相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。治療前A、B組雙歧桿菌及乳酸桿菌的數(shù)量明顯低于健康對(duì)照組(P＜0.01)。治療結(jié)束及停藥2個(gè)月時(shí),A組兩種桿菌較治療前均顯著增加(P＜0.01),B組兩種桿菌較治療前均無(wú)顯著差異。結(jié)論: 益生菌可通過(guò)增加腸道雙歧桿菌及乳酸桿菌菌群而改善病情并延緩復(fù)發(fā)。

腸道菌群； 特應(yīng)性皮炎； 益生菌

近年來(lái),特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis,AD)腸道菌群狀況異常與AD的關(guān)系受到重視,有研究報(bào)道嬰幼兒AD存在腸道微生物菌群失調(diào),益生菌在預(yù)防和治療兒童過(guò)敏性疾病(如AD)有效。1,2但目前對(duì)益生菌治療成年AD的研究較少,本實(shí)驗(yàn)對(duì)成年AD患者的腸道菌群狀況及益生菌對(duì)該病療效進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 病例資料 我院皮膚科門(mén)診就診的37例AD患者入選本實(shí)驗(yàn),均符合Hanifin和Rejka AD診斷標(biāo)準(zhǔn)；3無(wú)其他伴發(fā)癥及系統(tǒng)疾病,治療前2周內(nèi)未外用糖皮質(zhì)激素治療；1個(gè)月內(nèi)未系統(tǒng)使用過(guò)糖皮質(zhì)激素；6個(gè)月內(nèi)未系統(tǒng)使用過(guò)益生菌、抗生素、環(huán)孢素或中藥治療,隨機(jī)分為A組和B組。A組19例:男9例,女10例,年齡19～42歲,平均32.21±1.46歲,病程14～43年,平均30年；B組18例:男10例,女8例,年齡19～44歲,平均30.71±2.06歲,病程14～42年,平均31年。本院體檢的健康人20名作為正常對(duì)照,男11名,女9名,年齡20～43歲,平均31.67±1.89歲。對(duì)照組排除過(guò)敏性哮喘,過(guò)敏性結(jié)膜炎,食物過(guò)敏等過(guò)敏性體質(zhì)者。A、B組及健康對(duì)照組在性別、年齡方面具有可比性。

1.2 治療方法 A組給予抗組胺藥、0.05%地奈德乳膏及益生菌制劑:益生菌選用雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片(國(guó)藥準(zhǔn)字S19980004),成分為長(zhǎng)型雙歧桿菌、保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌,4片/次,日3次,共12周。B組患者給予抗組胺藥及0.05%地奈德乳膏。治療期間,避免含有任何活菌的發(fā)酵食品,避免系統(tǒng)應(yīng)用抗生素。治療前后所有患者均進(jìn)行血常規(guī)、尿常規(guī)及肝腎功能檢測(cè)。

1.3 臨床療效判定 在治療前后、停藥2個(gè)月時(shí)進(jìn)行SCORAD和VAS評(píng)分,評(píng)價(jià)療效。

采用SCORAD計(jì)分系統(tǒng)對(duì)AD皮損及臨床嚴(yán)重度進(jìn)行評(píng)估,4包括皮膚病變范圍(A)、皮膚嚴(yán)重程度(B)、瘙癢和睡眠影響程度(C)。A:成人頭頸部、臀部各9%,軀干前后各13.5%,下肢各22.5%；14歲以下兒童頭頸部、臀各9%,軀干前后及下肢各18%,1%面積為1分。B:按上述部位0～3四級(jí)評(píng)分,癥狀、體征包括紅斑、丘疹或水腫、表皮剝脫、裂紋或皸裂、滲出或結(jié)痂、苔蘚化、皮膚干燥(評(píng)未受累皮膚)。C:按最近3晝夜平均評(píng)分,0～3四級(jí)評(píng)分法,總分＜15分為輕度；15～40分為中度；＞40分為重度。

采用視角模擬尺度分法(visual analogue scale, VAS)對(duì)瘙癢程度進(jìn)行評(píng)價(jià):用長(zhǎng)度為10 cm的標(biāo)尺,兩端10～0分別代表最癢至不癢,讓患者將游標(biāo)放置在能代表其瘙癢程度的位置上,醫(yī)生讀出評(píng)分結(jié)果。

1.4 腸道菌群檢測(cè)

1.4.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器 恒溫培養(yǎng)振蕩器ZHWY－2102C(上海智城分析儀器制造有限公司),－80℃超低溫冰箱(美國(guó)Thermo Forma公司),H fsafe－1200TE全排型生物安全柜(上海力申科學(xué)儀器有限公司),超凈工作臺(tái)VS－1300L－U(蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司),低溫離心機(jī)Sigma 3K15(Sigma公司),電熱恒溫水浴鍋HH－S(上海比朗公司),純水器(法國(guó)Milipore公司),移液器(德國(guó)Eppendorf公司),核酸蛋白檢測(cè)儀Nanodrop 2000(Thermo公司),9700基因擴(kuò)增儀(美國(guó)Applied Biosystems公司),電泳儀(Bio rad公司)及凝膠成像分析系統(tǒng)2200(美國(guó)阿爾法公司)。DNA分子標(biāo)準(zhǔn)marker(LIFE SCIENCE公司), TAE緩沖液(上海創(chuàng)賽科學(xué)儀器有限公司)等。普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒(離心柱型)、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型)、熒光染料(SYBR Green I)、TaqDNA多聚酶等均購(gòu)自北京天根生物公司。標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29212(糞腸球菌)、ATCC25922(大腸桿菌)、引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

1.4.2 糞便標(biāo)本的采集 分別取AD患者治療前后、停藥2個(gè)月時(shí)及健康對(duì)照者的新鮮糞便,用天平稱(chēng)取中段大便,每例取500mg,提取糞便細(xì)菌DNA,－20℃保存?zhèn)溆谩CR熒光定量檢測(cè)糞便內(nèi)的乳酸桿菌,雙歧桿菌,大腸桿菌,糞腸球菌,屎腸球菌含量。

1.4.3 檢測(cè)方法 分別提取2種標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC29212(糞腸球菌)、ATCC25922(大腸桿菌)和3例正常對(duì)照者糞便中屎腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌基因組DNA進(jìn)行常規(guī)PCR反應(yīng),取PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳檢測(cè)引物的特異性；取上述5種細(xì)菌的基因組DNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增、純化、稀釋、定量,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,以便為待測(cè)樣品的定量提供參照標(biāo)準(zhǔn)。將其余糞便標(biāo)本中提取的DNA分別進(jìn)行5種細(xì)菌的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),反應(yīng)體系:熒光染料9μL,上下游引物各1 μL,模板DNA 2.0μL,ddH2O 7μL,加石蠟油8μL,反應(yīng)體積為20μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性2 min,95℃變性20 s,雙歧桿菌57℃、乳酸桿菌58℃、大腸桿菌59℃、糞腸球菌60℃、屎腸球菌61℃退火30 s,68℃延伸30 s,40個(gè)循環(huán),74℃延伸1 min。每次實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品校正和ddH2O代替DNA模板作為陰性對(duì)照。反應(yīng)完畢后根據(jù)溶解曲線分析PCR產(chǎn)物的特異性,并由PCR儀分析定量結(jié)果,每份糞便標(biāo)本所含的5種細(xì)菌的拷貝數(shù)可通過(guò)循環(huán)數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較得到。結(jié)果以每克濕便的細(xì)菌拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)(以10為底數(shù))表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以ˉx±s表示,數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 18.0軟件,進(jìn)行t檢驗(yàn)及方差檢驗(yàn),P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 SCORAD和VAS評(píng)分結(jié)果 見(jiàn)表2。

2.2 熒光定量PCR檢測(cè)5種腸道細(xì)菌數(shù)量結(jié)果 見(jiàn)表3。引物特異性檢測(cè)結(jié)果及溶解曲線(單峰)均證明擴(kuò)增產(chǎn)物單一。

表1 5種細(xì)菌的PCR擴(kuò)增引物序列

表2 治療前后SCORAD和VAS評(píng)分比較

表3 各組糞便標(biāo)本細(xì)菌定量檢測(cè)結(jié)果

2.3 不良反應(yīng) 治療期間兩組患者均未見(jiàn)血、尿常規(guī)及肝腎功能異常及其它不良反應(yīng)。

3 討論

腸道益生菌在誘導(dǎo)免疫耐受、抑制過(guò)敏性疾病的發(fā)生和改善癥狀方面起著重要的作用,嬰幼兒AD患者存在腸道菌群狀況異常。2,5本試驗(yàn)結(jié)果提示成年AD患者也存在腸道菌群失調(diào)的情況,主要為雙歧桿菌及乳酸桿菌的數(shù)量明顯減少,而大腸桿菌、糞腸球菌和屎腸球菌的數(shù)量則無(wú)明顯變化。Roessler等6進(jìn)行了一項(xiàng)隨機(jī)雙盲對(duì)照研究,結(jié)果顯示意大利成人AD病患組較健康組糞便乳酸桿菌數(shù)量降低,與我們的結(jié)果一致,但雙歧桿菌的數(shù)量與健康人無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,與本研究結(jié)果不同,這可能與兩研究間檢測(cè)方法、歐亞地區(qū)人種及飲食習(xí)慣不同有關(guān)。

益生菌是一類(lèi)定居在腸道中的有益細(xì)菌,有助于改善腸道免疫屏障功能、調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫反應(yīng)、降低腸道炎癥反應(yīng)。益生菌對(duì)預(yù)防、治療過(guò)敏性疾病有效,可以減輕AD和牛奶過(guò)敏兒童的皮膚及腸道炎癥。7,8本試驗(yàn)結(jié)果顯示,口服益生菌12周能明顯上調(diào)AD患者腸道中雙歧桿菌及乳酸桿菌的數(shù)量,停藥后2個(gè)月時(shí)上述2種細(xì)菌的數(shù)量仍可以維持在正常水平,同時(shí)非益生菌組患者僅在治療結(jié)束時(shí)SCORAD和VAS評(píng)分較治療前改善,好轉(zhuǎn)原因考慮與基礎(chǔ)用藥(抗組胺藥物及外用藥物)對(duì)病情改善有關(guān),但停藥后2個(gè)月時(shí)病情有反復(fù)；益生菌組的患者在經(jīng)過(guò)12周的益生菌及常規(guī)治療后SCORAD和VAS評(píng)分均較治療前明顯改善,且停藥后2個(gè)月病情無(wú)明顯反復(fù),考慮與口服益生菌改善腸道內(nèi)環(huán)境、加強(qiáng)腸道免疫屏障功能、減輕菌群失調(diào)所致的變態(tài)反應(yīng)有關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,成年AD患者的腸道菌群與正常人群存在差異；口服益生菌可改善AD患者的腸道菌群,且無(wú)明顯不良反應(yīng),可為過(guò)敏性疾病的防治提供有效的途徑。但本實(shí)驗(yàn)樣本量較小,今后開(kāi)展多中心、大樣本、雙盲對(duì)照研究,將會(huì)更全面地反映成人AD患者腸道菌群的情況及益生菌治療AD的療效及機(jī)制。

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(收稿:2014－01－18 修回:2014－02－08)

Assessment of efficacy of probiotics in the treatment of atopic dermatitis

JIANG Li-ya,GUO Zhen,DAIJing－bin,etal.Liaocheng People′s Hospital,Liaocheng,252000

Objective:To evaluate clinical efficacy of probiotics for the treatment of adult AD patients.Methods:Forty patientswere enrolled in thisstudy and divided into two groups:the patients in the probiotics group were treated with antihistamine,topical steroid and probiotics.The patients in the non－probiotics group were treated with antihistamine and topical steroid only.The course of the treatment was 12 weeks.Twenty healthy peop le were used as control.The disease severity was assessed by SCORAD and VAS score at baseline,week 12 and month 2 after stopping the treatment.The change in fecalmicrobiota was detected by PCR.Results:The SCORAD and VAS scoreswere significantly reduced in the two groups(P＜0.01)after the treatment,compared with those before the treatment.Atmonth 2 after stopping the treatment,the SCORAD and VAS scores continued to be lower than those atbaseline in the probiotics group(P＜0.01),but not in the non－probiotics group.Before the treatment,the amount of Bifidobacterium and Lactobacilli in stool of the two groupswas higher than that in the healthy control(P＜0.01).At end of the treatmentand month 2 after stopping the treatment,the amount of Bifidobacterium and Lactobacilli was significantly increased(P＜0.01)in probiotics group,rather than in non－probiotics group.Conclusion:Probiotics can improve the clinical status of the disease through increasing the amount of Bifidobacterium and Lactobacilli,and prolong relapse of AD.

intestinal flora；atopic dermatitis；probiotics

山東省聊城市人民醫(yī)院,聊城,252000