趙宇明

（大連市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，遼寧大連116021）

分光光度法快速測(cè)定水產(chǎn)品中組胺的含量

趙宇明

（大連市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，遼寧大連116021）

用三氯乙酸提取水產(chǎn)品中的組胺，再與偶氮試劑反應(yīng)生成紅色化合物，其吸光度與樣品中的組胺含量成正比，依此建立了快速測(cè)定水產(chǎn)品中組胺的方法。方法的檢出限為2.0μg/mL，RSD（n=10）為2.6%，10次測(cè)定的平均回收率為99.5%，在0～40μg/mL范圍內(nèi)，r為0.9998。該方法具有快速、穩(wěn)定的特點(diǎn)，與國(guó)標(biāo)方法所得測(cè)定結(jié)果基本一致。

組胺；水產(chǎn)品；紫外可見(jiàn)分光光度法

組胺是一種生物堿，廣泛存在于動(dòng)植物體內(nèi)。魚(yú)類(lèi)等水產(chǎn)物的機(jī)體在腐敗過(guò)程中組胺酸通過(guò)微生物的作用，脫羧產(chǎn)生有毒性的組胺。當(dāng)人體攝入組胺超過(guò)100mg時(shí)，即出現(xiàn)不良反應(yīng)和中毒癥狀。水產(chǎn)品中組胺的測(cè)定方法有生物學(xué)法、薄層層析法、液相色譜法、熒光法、分光光度法[1-6]等。我國(guó)測(cè)定水產(chǎn)品中組胺的方法為國(guó)標(biāo)法（GB/T5009.45-2003《水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》）。國(guó)標(biāo)法操作繁瑣、費(fèi)時(shí)，存在較多缺陷。研究快速測(cè)定組胺含量的方法，對(duì)水產(chǎn)品中組胺含量進(jìn)行有效的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)與評(píng)價(jià)，可以為新檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)的建立提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原理

用三氯乙酸提取水產(chǎn)品中的組胺，再與偶氮試劑反應(yīng)生成紅色化合物，其吸光度與樣品中的組胺含量成正比。樣品與標(biāo)準(zhǔn)系列比較后定量。

1.2 主要試劑和儀器

FK-A組織粉碎機(jī)：江蘇環(huán)宇；MX-S渦旋振蕩器：美國(guó)SCILOGEX；UV-2550紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：日本島津；HM-120型電子天平：廣東東華；Arium611型超純水器：德國(guó)Sartorius公司；THZ-82B恒溫水?。撼Ｖ葜遣┤?；PHS-3C型pH計(jì)：上海偉業(yè)。正戊醇、三氯乙酸、碳酸鈉、氫氧化鈉、鹽酸、組胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液、對(duì)氨基苯磺酸鈉、亞硝酸鈉等試劑均購(gòu)自于商業(yè)渠道。

1.3 方法

1.3.1 樣品測(cè)定液的提取

去除樣品中不可食用部分，用組織粉碎機(jī)搗碎并混勻，準(zhǔn)確稱(chēng)取5.00 g左右的試樣于具塞三角瓶（或體積適合的聚四氟乙烯離心管）中，加入20mL三氯乙酸溶液（100 g/L），在渦旋振蕩器上渦旋約5min后，過(guò)濾。殘?jiān)眠m量水洗滌2次～3次，合并所有濾液，用氫氧化鈉溶液（250 g/L）將濾液pH調(diào)至5.00±0.05，再用水定容至100mL容量瓶中備用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及樣品測(cè)定

將組胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100μg/mL）稀釋為組胺標(biāo)準(zhǔn)使用液（10μg/mL），在6只20mL具塞比色管中各自準(zhǔn)確吸取組胺標(biāo)準(zhǔn)使用液0、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00mL，分別補(bǔ)水至5.00mL（相當(dāng)于0、5.00、10.00、20.00、30.00、40.00μg組胺），各管中分別加入5.00mL對(duì)氨基苯磺酸鈉稀堿溶液（5.0 g/L）和0.30mL亞硝酸鈉鹽酸溶液（50.0 g/L），渦旋混勻后，室溫放置10min～15min，以零管為參比在波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。準(zhǔn)確吸取適當(dāng)體積的樣品測(cè)定液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)同樣操作測(cè)得吸光度值，并與標(biāo)準(zhǔn)系列比較，計(jì)算出樣品中組胺含量。

1.3.3 計(jì)算公式

式中：X為水產(chǎn)樣品中組胺的含量，（mg/100 g）；M為水產(chǎn)樣品的質(zhì)量，g；m1為被測(cè)定樣液中組胺的質(zhì)量，μg；V0為測(cè)定時(shí)吸取被測(cè)樣液的體積，mL；V1為樣品測(cè)定液定容體積，mL。

2 結(jié)果與分析

2.1 組胺的吸收光譜

按實(shí)驗(yàn)方法，350 nm～550nm處進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 組胺的紫外可見(jiàn)吸收光譜Fig.1 Ultraviolet and visible absorption spectrum of histamine

吸光度在350 nm～450 nm內(nèi)逐漸增加，在450 nm達(dá)到最大，之后吸光度逐漸下降，因而選擇450 nm作為工作波長(zhǎng)。組胺與偶氮試劑的重氮偶合反應(yīng)是組胺陰離子與親電試劑在堿性水溶液中反應(yīng)。偶合后得到紅色偶合物，用紫外可見(jiàn)光譜法進(jìn)行比色定量。

2.2 介質(zhì)的選擇

不同介質(zhì)所提供的酸堿性環(huán)境對(duì)萃取效果的影響不同，在pH＞7的條件下更易于組胺與偶氮試劑發(fā)生偶合反應(yīng)的進(jìn)行，因而提取時(shí)應(yīng)將樣品溶液的pH調(diào)控到適宜的范圍才能確保萃取效果最佳。在pH8.5～13.5區(qū)間范圍內(nèi)考察組胺的回收率，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2不同pH對(duì)萃取效果的影響Fig.2 Effect of different pH on the extraction effcinecy

圖2 表明，當(dāng)樣品溶液的pH=11.0時(shí)，組胺的回收率最高，即萃取的效果最好，因此選擇樣品溶液的最佳pH為11.0，最佳介質(zhì)為NaOH溶液。

2.3 反應(yīng)溫度、時(shí)間和穩(wěn)定性

經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)時(shí)間過(guò)短，溶液顯橘黃色，本偶聯(lián)反應(yīng)在室溫條件下10min以上才能充分完成，實(shí)驗(yàn)選擇在室溫下放置10min～15min。在環(huán)境溫度明顯低于室溫條件下，改用恒溫水浴調(diào)節(jié)溫度在20℃～25℃之間，保溫10min～15min。本染料形成后，在適宜的介質(zhì)中2 h內(nèi)溶液顯棕紅色，吸收特征無(wú)變化。樣品溶液穩(wěn)定，適合直接測(cè)定。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及方法檢出限

按上述測(cè)定條件，研究了組胺與偶氮試劑結(jié)合體系在450 nm處的吸光度A與濃度C（μg/mL）的關(guān)系，得到線(xiàn)性回歸方程為A=0.019C+0.005 6，相關(guān)系數(shù)r=0.999 8。線(xiàn)性范圍為0～40μg/mL，方法的檢出限為2.0μg/mL。

2.5 方法準(zhǔn)確度和精密度的確定

取5種不同品種的水產(chǎn)品進(jìn)行加標(biāo)，按實(shí)驗(yàn)方法顯色測(cè)定組胺的回收率，考察方法的準(zhǔn)確度，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 測(cè)定方法的準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=10）Table1 Experiment results of detection method accuracy（n=10）

可見(jiàn)，5種水產(chǎn)樣品中，組胺均不同程度檢出。本測(cè)定方法的回收率為95.1%～105.1%，平均回收率為99.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.6%，準(zhǔn)確度較高。按實(shí)驗(yàn)方法，平行測(cè)定6種水產(chǎn)樣品各10次，對(duì)測(cè)得結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)偏差S和變異系數(shù)C.V%，考察該方法的精密度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 測(cè)定方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果Table2 Experiment results of detection method precision mg/100 g

由表2可見(jiàn)，本方法的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.15～0.23，變異系數(shù)為0.001～0.019，精密度較高。

2.6 選擇性試驗(yàn)

研究各種銨鹽、氨基酸等對(duì)10μg/mL組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的影響，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 共存物對(duì)10μg/m L組胺標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定的影響Table3 Effects of the fofeign substances on the determination of 10μg/m L histamine standard solution

可見(jiàn)，在±5%相對(duì)誤差內(nèi)，大部分共存物的存在對(duì)測(cè)定無(wú)影響，說(shuō)明該方法具有較好的選擇性。

2.7 比較試驗(yàn)

為了進(jìn)一步考察方法的可行性，取10份水產(chǎn)樣品分別用本方法和國(guó)標(biāo)法（對(duì)硝基苯胺法）測(cè)定組胺含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 與國(guó)標(biāo)法的比較結(jié)果Table4 Compared results of national standard GB and this method mg/100 g

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，t=1.88，p＞0.05，證明兩種方法無(wú)明顯差異。

3 結(jié)論

本方法測(cè)定水產(chǎn)品中的組胺含量，避免了國(guó)標(biāo)法中致癌物對(duì)硝基苯胺的使用。通過(guò)準(zhǔn)確控制反應(yīng)體系的pH，使顯色反應(yīng)穩(wěn)定，便于比色操作。方法簡(jiǎn)單、快速、回收率較高，方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性好，與國(guó)標(biāo)法相比，測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異，適合于水產(chǎn)品中的組胺含量的檢測(cè)，具有一定的應(yīng)用和推廣價(jià)值。

[1]金安寶.水產(chǎn)品中組胺測(cè)定方法的改進(jìn)[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2007,17(1):149-150

[2]王永根,沈永偉,王劍波.水產(chǎn)品中組胺檢測(cè)方法的探討[J].職業(yè)與健康,2007,23(8):657

[3]郝宏蘭.水產(chǎn)品中組胺的測(cè)定方法研究[J].食品科學(xué),2000,21(8): 46-48

[4]竇紅順.水產(chǎn)品組胺檢測(cè)方法的改進(jìn)[J].福建紡織,2013(6):37-42

[5]王麗玲,白艷玲.水產(chǎn)品組胺測(cè)定中鹽酸量對(duì)結(jié)果影響的探討[J].現(xiàn)代科學(xué)儀器,2001(5):55

[6]李佐卿,謝東華,王宇,等.高效液相色譜熒光檢測(cè)器快速測(cè)定水產(chǎn)品中的組胺[J].光譜實(shí)驗(yàn)室,2000,17(5):592-595

Rapid Detection Histamine Content in Aquatic Product Using Spectrophotometry

ZHAO Yu-ming
（Dalian Institute of Product Quality Supervision and Inspection，Dalian 116021，Liaoning，China）

Trichloroacetic acid was used to extract histamine in aquatic products then reacted with azo reagent and generated red compound.The absorbance was proportional to the histamine content in the samples and according to this I established a fast method of determination histamine in aquatic products.The detection limit was2.0μg/mL.The relative standard deviation（n=10）was 2.6% and the average recovery of histamine derivative（n=10）was 99.5%.The dependent coefficient of the linear function was 0.999 8 in the range of 0-40μg/mL.The results obtained by this method was rapid，stable.And the results were same with that obtained by Kjeldahlˊs method.

histamine；aquatic product；ultraviolet and visible spectrophotometry

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.08.025

2013-11-15

趙宇明（1977—），男（漢），工程師，研究生，研究方向：分析化學(xué)。