王志華，顏永斌，江陽陽，李偉，覃彩芹，*

（1.特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北重點實驗室，湖北工程學院，湖北孝感432000；2.生物質(zhì)資源化學與環(huán)境生物技術湖北省重點實驗室，湖北工程學院，湖北孝感432000）

殼聚糖是自然界中僅次于纖維素的第二大可再生資源，廣泛存在于蝦、蟹等甲殼類動物外殼及真菌細胞壁。作為自然界中唯一的含氮堿性多糖，殼聚糖具有良好的生物降解性、生物相容性，安全無毒，廣泛應用于醫(yī)藥、紡織、化妝品、造紙、食品工程、化工、農(nóng)業(yè)等領域[1-2]。大量研究表明，殼聚糖具有抗腫瘤、降膽固醇、增強免疫功能、抗糖尿病、愈傷和抗菌等多種生物學活性[3-6]。自1983年美國食品藥物管理署（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準殼聚糖作為飼料添加劑以來，殼聚糖及其衍生物在食品工業(yè)中的應用日益受到社會的關注，如抗菌劑、抗氧化劑、水果保鮮劑等[7-8]。

殼聚糖分子中每個糖殘基上存在相鄰的氨基和羥基，在一定的pH條件下，能夠有效絡合金屬離子[9]。我們已有的研究顯示攝食不同分子量的殼聚糖及其衍生物對小鼠體內(nèi)金屬元素的影響不同。用含1%樣品的基礎飼料喂食小鼠90 d，不同分子量的殼聚糖[10]及其羥丙基殼聚糖（hydroxypropyl chitosan，HPCS）衍生物[11]對小鼠體內(nèi)肝、心、腎等組織中Fe和Zn含量沒有明顯影響，但是用含0.75%樣品的基礎飼料喂食小鼠30 d，羧甲基殼聚糖[12]和季銨化殼聚糖[13]卻明顯降低了小鼠體內(nèi)肝、心、腎等組織中Fe和Zn含量。殼聚糖的衍生化產(chǎn)物有不同的理化性質(zhì)，也會影響其在體內(nèi)的生化作用。

鉛作為聯(lián)合國糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）公布的對人體毒性最強的三種重金屬（鉛、鎘、汞）之一，廣泛分布并共存于自然界中，是環(huán)境中常見的化學毒物。隨我國社會經(jīng)濟的快速發(fā)展，自然環(huán)境的鉛污染日益嚴重，已引起人們的高度重視。長期飲食受不同程度鉛污染的食品和飲用水，對人體健康產(chǎn)生多方面的危害，甚至引起鉛中毒。對于鉛中毒，臨床上普遍采用二巰丁二酸、依地酸二鈉鈣等藥物治療，排鉛效果雖好，導致諸多不良反應，并且這種治療方法不宜用于鉛慢性中毒的預防及治療[14]。我們前期研究顯示分子量較大的水溶性殼聚糖使小鼠的毛發(fā)、肝、脾和心臟中的Pb含量有所降低[15]。水溶性HPCS沒有明顯的急性毒性[16]，但是攝食它對元素Pb是否有富集或促排作用不甚清楚。本文探討攝食HPCS對正常小鼠體內(nèi)鉛水平的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖：浙江金殼生物化學有限公司，65%濃HNO3和HClO4為優(yōu)級純試劑，其他試劑均為分析純。昆明小鼠（18 g～22 g）和其食用的基礎飼料（19.1%粗蛋白，12.13%氨基酸，4.80%粗纖維，4.25%粗脂肪，7.17 mg/kgCu，525.97mg/kgFe，85.19mg/kgZe，1.198mg/kg Pb，5.47 g/kg Ca）由湖北省實驗動物中心提供。

1.2 儀器與設備

倒置熒光顯微鏡，日豐尼康公司；TAS-986原子吸收分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 HPCS的制備

將一定量殼聚糖分散在異丙醇中，加入一定量33%NaOH水溶液，-18℃冷凍堿化48 h；室溫解凍后，加入一定量的環(huán)氧丙烷和10%的四甲基氫氧化銨溶液，將混合物在45℃下攪拌回流過夜；所得的產(chǎn)物用1∶1（體積比）HCl中和至中性，用蒸餾水透析3 d，除去其中的鹽份，所得溶液在60℃下減壓濃縮，用大量的丙酮沉淀后，將沉淀物真空干燥即得HPCS衍生物。其分子量測定采用凝膠滲透色譜法，按照我們已發(fā)表的論文方法操作[17]。HPCS的重均分子量Mw為 1.6×105。

1.3.2 攝食HPCS對小鼠體內(nèi)鉛水平影響的實驗

將40只健康的雌性昆明小鼠隨機分為四個組，一個對照組喂食小鼠基礎飼料，三個實驗組分別喂食質(zhì)量分數(shù)為1.5%、1.0%、0.1%HPCS的飼料。持續(xù)喂養(yǎng)，每周稱重，第90天將小鼠頸椎脫臼處死，取出肝臟、腎臟、脾臟、心臟和股骨稱重。抽取1.5%HPCS實驗組和對照組小鼠部分肝臟，經(jīng)固定、脫水、浸蠟、包埋、切片，每隔20張取一張，每個材料取4張，脫蠟，蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosinstaining，HE）染色制片，分別在放大倍數(shù)為10×40的倒置熒光顯微鏡下觀察拍照。

稱取0.1 g～0.2 g臟器和股骨，向其中加5 mL HNO3和1 mL HClO4在150℃條件下消解為澄清液，冷卻后用雙蒸餾水定容至10.00 mL。用TAS-986原子吸收分光光度計通過石墨爐法測定樣品中的Pb2+濃度。最后采用SPSS11.5生物統(tǒng)計學One-Way ANOVA進行數(shù)據(jù)處理，比較實驗組與對照組的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 攝食HPCS對小鼠體重的影響

小鼠攝食含有0.1%，1.0%和1.5%HPCS的基礎飼料90 d，在實驗期內(nèi)活動、生長正常，均未表現(xiàn)臨床的中毒癥狀。其體重的變化見表1。

表1 小鼠體重的變化（g，±s，n=10）Table 1 Body weight changes of mice（g，±s，n=10）

表1 小鼠體重的變化（g，±s，n=10）Table 1 Body weight changes of mice（g，±s，n=10）

?

如表1所示，各組小鼠初始體重相近，實驗結(jié)束時，HPCS實驗組與對照組無明顯差異。小鼠的臟器指數(shù)變化結(jié)果見表2。

表2 小鼠體重的臟器指數(shù)（g/100 g，±s，n=10）Table 2 Organ/body weight ratios of the mice（g/100 g，±s，n=10）

表2 小鼠體重的臟器指數(shù)（g/100 g，±s，n=10）Table 2 Organ/body weight ratios of the mice（g/100 g，±s，n=10）

?

可以看出攝食HPCS對肝、肺、心、脾、腎等的臟器指數(shù)無明顯影響。圖1顯示在顯微鏡下觀察肝組織，實驗組與對照組相比無異常，肝細胞成行排列成整齊的肝索，肝竇清晰可見，核仁清晰，胞漿豐滿，表明HPCS對肝組織無損傷。

圖1 小鼠肝臟組織HE染色照片F(xiàn)ig.1 The micrographs of mouse liver tissue stained by HE

2.2 攝食HPCS對小鼠器官中鉛含量的影響

攝食HPCS 90 d對小鼠器官中鉛含量影響見表3。

表3 攝食HPCS 90 d小鼠器官中鉛含量（μg/kg，±s，n=10）Table 3 The concentrations of Pb in organs of the mice（μg/kg，±s，n=10）

表3 攝食HPCS 90 d小鼠器官中鉛含量（μg/kg，±s，n=10）Table 3 The concentrations of Pb in organs of the mice（μg/kg，±s，n=10）

注：bP＜0.01。

?

可以從表3中看出，各實驗組小鼠的肝、脾、心和腎中的鉛含量與對照組相比無統(tǒng)計學意義，但1.0%HPCS和1.5%HPCS樣品組股骨中的鉛含量與對照組相比呈極顯著性差異（p＜0.01）。

3 討論

鉛是一種蓄積性毒物，居6類重金屬污染之首，被世界衛(wèi)生組織列為可能的致癌物質(zhì)之一。環(huán)境中的鉛主要通過消化道吸入體內(nèi)，大量研究表明鉛對全身各系統(tǒng)和器官均有毒性作用，尤其對兒童、孕婦的危害性更大，對發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)損傷尤為明顯[19]。鉛經(jīng)主動轉(zhuǎn)運和被動擴散兩種方式由小腸吸收入血[20]，進入血液的鉛，形成可溶性的鉛鹽，并隨血液分布在肝、腎、腦等組織器官，數(shù)周后95%的鉛轉(zhuǎn)移到骨性組織，沉積在骨骼系統(tǒng)。骨組織是體內(nèi)最大的鉛儲存庫，因此，骨鉛含量可以比較確切地反應排鉛和驅(qū)鉛的效果。小鼠攝食HPCS后，1.5%HPCS組和1.0%HPCS組與對照組相比，股骨中鉛水平顯著下降。HPCS分子含有氨基，在適當條件下能夠絡合金屬陽離子。飼料中添加的HPCS有可能在血液中絡合鉛離子進入肝組織，致使肝中Pb含量增加，但是隨著HPCS量增加，有效吸附基團的增多，使得被吸收的HPCS分子對Pb吸附量增加，然后通過腎代謝除去Pb，使骨中Pb含量下降。

攝食HPCS對小鼠體重無明顯影響，對肝組織器官無損傷，沒有造成重金屬鉛在體內(nèi)的蓄積，雖然小鼠攝食1.0%和1.5%HPCS的基礎飼料使股骨鉛水平明顯下降，其作用機理及其排鉛效果有待進一步研究。

[1] Kumar M N V R,Muzzarelli R A A,Muzzarelli C,et al.Chitosan chemistry and pharmaceutical perspectives[J].Chemical Reviews,2004,104:6017-6084

[2]Bansal V,Sharma P K,Sharma N,et al.Applications of chitosan and chitosan derivatives in drug delivery[J].Advances in Biological Research,2011,5:28-37

[3]Qin C Q,Li H R,Xiao Q,et al.Water-solubility of chitosan and its antimicrobialactivity[J].CarbohydratePolymers,2006,63:367-374

[4] Gades D M,Stern J S.Chitosan supplementation and fecal fat excretion in men[J].Obesity Research,2003,11:683-688

[5] Qin C Q,Du Y M,Xiao L,et al.Enzymic preparation of water-soluble chitosan and their antitumor activity[J].International Journal of Biological Macromolecules,2002,31:111-117

[6] Gallaher C M,Munion J,Hesslink J R,et al.Cholesterol reduction by glucomannan and chitosan is mediated by changes in cholesterol absorption and bile acid and fat excretion in rats[J].Journal of Nutrition,2000,130:2753-2759

[7] 匡銀近,龍晶,徐東生,等.不同分子量的殼聚糖在草莓保鮮中的作用[J].食品科學,2010,31(2):241-244

[8] Harish Prashanth K V,Tharanathan R N.Chitin/chitosan:modifications and their unlimited application potential[J].Trends in Food Science&Technology,2007,18:117-131

[9] Varma A J,Deshpande S V,Kennedy J F,et al.Metal complexation by chitosan and its derivatives:a review[J].Carbohydrate Polymers,2004,55:77-93

[10]Zeng L T,Qin C Q,Wang W,et al.Effect of dietary chitosans on trace iron,copper and zinc in mice[J].Carbohydrate Polymers,2008,74(2):279-282

[11]Wang Z H,Yan Y B,Jiang Y Y,et al.Effect of orally administered hydroxypropyl chitosan on the levels ofiron,copper,zinc and calcium in mice[J].International Journal of Biological Macromolecules,2014,64:25-29

[12]Wang W,Qin C Q,Ding Y,et al.Effect of dietary carboxymethyl chitosans on the levels of iron,zinc and copper in mice[J].Carbohydrate Polymers,2010,81(2):203-206

[13]Wang L S,Qin C Q,Wang W,et al.Effect of orally administered N-(2-hydroxyl)propyl-3-trimethyl ammonium chitosan on the levels of iron,zinc,copper,calcium and lead in mice[J].Carbohydrate Polymers,2011,84(2):1289-1292

[14]楊樹,陳立,尹艷艷,等.噴替酸鋅鈉對鉛中毒小鼠的驅(qū)鉛作用研究[J].解放軍藥學學報,2011,27(2):147-149

[15]覃彩芹,曾林濤,李偉.攝食殼聚糖對小鼠體內(nèi)鉛水平的影響[J].食品科學,2009,30(1):246-248

[16]Peng Y F,Han B Q,Liu W S,et al.Preparation and antimicrobial activity of hydroxypropyl chitosan[J].Carbohydrate Research,2005,340:1846-1851

[17]Qin C Q,Zhou B,Zeng L T,et al.The physicochemical properties and antitumor activity of cellulase-treated chitosan[J].Food Chemistry,2004,84:107-115

[18]王龍昌,王恬,周巖民.動物食品中鉛污染現(xiàn)狀及飼料控制技術研究進展[J].食品科學,2010,31(13):302-306

[19]Flora G,Gupta D,Tiwari A.Preventive efficacy of bulk and nanocurcumin against Lead-induced oxidative stress in mice[J].Biological Trace Element Research,2013,152:31-40

[20]Fairweathr-Tait S,Hurrell R F F.Bioavailability of mineral and trace elements[J].Nutrition Research Reviews,1996,9:295-324