宋薇，宋桂雪，李榮斌，陳曉旭，趙永彪

（譜尼測試科技股份有限公司，北京100080）

近年來，隨著添加有無根劑、植物生長激素、漂白劑、抗菌劑、尿素等非食用成分的毒豆芽不斷有報(bào)道，豆芽的食用安全引起大家的密切關(guān)注和評(píng)論。尿素原可作為食品工業(yè)加工助劑，見GB2760-2007版《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》，但在GB2760-2011《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中已不包括尿素。國家標(biāo)準(zhǔn)GB 22556-2008《豆芽衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》只籠統(tǒng)規(guī)定了食品添加劑的品種和使用量應(yīng)符合國標(biāo)GB 2760的規(guī)定，其它也只規(guī)定了鉛、亞硫酸鹽和微生物的限量。豆芽的地方標(biāo)準(zhǔn)中，如四川省DB 51/T 1061-2010《豆芽》、北京市DB 11/377-2006《豆芽安全衛(wèi)生要求》、青島市DB 3702/T 090-2006《豆芽生產(chǎn)管理技術(shù)規(guī)范》和浙江省DB 33/625.2-2007《無公害豆芽質(zhì)量安全要求》等標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)豆芽的理化指標(biāo)限量較多，也只規(guī)定了重金屬含量、農(nóng)藥、獸藥殘留的限量，對(duì)尿素含量限量沒有規(guī)定。

目前，尿素的檢測方法主要有兩類：第一類是比色法，如二乙酰一肟比色法、對(duì)二甲氨基苯甲醛比色法、鄰苯二甲醛比色法、丁二酮肟比色法檢測食品中的尿素[1-3]；第二類是液相色譜法（HPLC）。然而由于豆芽基質(zhì)比較復(fù)雜，且本身帶有顏色，采用比色法測定，易造成假陽性，致使結(jié)果發(fā)生偏差。HPLC法中，用溶劑直接提取樣品，采用反相C18柱，二極管陣列檢測器在紫外區(qū)域190 nm～205 nm或?qū)⒛蛩匮苌罄脽晒鈾z測器（FLD）檢測化妝品、土壤、尿液、紅酒、黃酒中的尿素含量[4-8]，利用HPLC法檢測豆芽中的尿素未見報(bào)道。豆芽中尿素的檢測，常見的比色法，然而由于豆芽基質(zhì)比較復(fù)雜，且本身帶有顏色，采用比色法造成假陽性，致使結(jié)果發(fā)生偏差。

呫噸氫醇，又稱9-羥基呫噸、占頓醇，是一個(gè)傳統(tǒng)的測定尿素肥料的試劑，如ISO 8603：1993測定固體肥料尿素態(tài)氮含量的測定就用呫噸氫醇重量法，在醋酸溶液中，尿素中的酰胺與呫噸氫醇生成二呫噸脲沉淀。然而尿素也可以和呫噸氫醇生成具有熒光效應(yīng)的9-脲基呫噸[7]，本文利用該原理對(duì)豆芽中尿素進(jìn)行衍生，建立了測定豆芽中尿素的HPLC-FLD法，并對(duì)市售豆芽和實(shí)驗(yàn)室自發(fā)豆芽進(jìn)行了檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200液相色譜儀（配G1321B熒光檢測器）：美國安捷倫公司；家用多功能粉碎機(jī)：上海昂尼公司；Vertex Genie 2渦旋混合器：美國Scientific Industries公司；CT15RT高速冷凍離心機(jī)：上海天美公司；DHP恒溫培養(yǎng)箱：江蘇麥普龍公司。

呫噸氫醇標(biāo)準(zhǔn)品（Xanthydrol，純度98%）：美國Alfa Aesar公司；尿素（高純?cè)噭?，J&K）：Chemical公司；無水乙醇、鹽酸、無水乙酸鈉均為分析純，水為一級(jí)水。

呫噸氫醇衍生試劑：稱取0.404 g呫噸氫醇，用無水乙醇溶解并定容至100 mL，配制4.04 mg/mL呫噸氫醇溶液，避光冷藏備用，有效期3個(gè)月。

尿素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取尿素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg（精確至0.01 mg）于10 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解，并定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的尿素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃保存，有效期3個(gè)月；將尿素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用無水乙醇稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃保存，有效期3個(gè)月。

試樣：實(shí)驗(yàn)室自發(fā)豆芽所用的綠豆和黃豆均購自大型超市，在實(shí)驗(yàn)室經(jīng)40℃左右溫水浸泡3 h～4 h后，然后轉(zhuǎn)入底部帶孔的塑料托盤中，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每天換水3次～4次，發(fā)芽時(shí)間3 d～4 d不等。袋裝貼有綠色食品標(biāo)志豆芽（簡稱綠色豆芽）采購于超市，分別選取3種不同企業(yè)的產(chǎn)品。散裝豆芽采購自集貿(mào)市場和超市。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件的選擇

采用AgilentEclipseXDB-C18柱，150mm×4.6mm，5 μm。流動(dòng)相：A為乙腈；B為0.02 mol/L乙酸鈉溶液；流動(dòng)相梯度洗脫：從0～12 min，A由20%遞增到50%，B由80%遞減到50%；從12 min～13 min，A由50%遞增到100%，并保持5 min。流速為1.0 mL/min。熒光檢測器激發(fā)波長λex=213 nm，發(fā)射波長λem=308 nm；進(jìn)樣量 10 μL；柱溫 35℃。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將尿素標(biāo)準(zhǔn)液分別稀釋成質(zhì)量濃度為1、2、5、10、25、50 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列，分別取300 μL尿素標(biāo)準(zhǔn)液，加入300 μL呫噸氫醇溶液和20 μL一定濃度的稀鹽酸，避光衍生反應(yīng)，衍生產(chǎn)物用HPLC-FLD進(jìn)行檢測。

然后根據(jù)峰面積與質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 樣品制備

1.3.1 樣品前處理

豆芽用食品粉粹機(jī)粉碎均漿。精確稱取試樣2 g（精確到0.000 1g）于50 mL塑料離心管中，加入無水乙醇，定容至10 mL。振蕩提取30 min后離心8 000 r/min 5 min，上清液經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾備用。

1.3.2 衍生

取300 μL濾液，加入氫醇溶液和稀鹽酸，依照1.2.2步驟和本文優(yōu)化后的條件衍生后上機(jī)檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 衍生試劑

在酸性條件下，尿素和呫噸氫醇生成衍生產(chǎn)物9-脲基呫噸（9-Carbamido xanthydrol），經(jīng) HPLC 分離后熒光檢測器檢測。我們將該原理應(yīng)用于豆芽中尿素的檢測，且對(duì)衍生產(chǎn)物進(jìn)行熒光檢測，可以有效避免比色法中豆芽其他有機(jī)成分對(duì)尿素的嚴(yán)重干擾。熒光檢測器檢測波長采用λex213 nm，λem308 nm[7]。尿素和呫噸氫醇的反應(yīng)式見圖1。

圖1 尿素與呫噸氫醇的反應(yīng)式Fig.1 The reaction of urea and xanthydrol

2.2 反應(yīng)的特異性

呫噸氫醇一般與具有酰胺結(jié)構(gòu)的分子發(fā)生反應(yīng)。雖然豆芽發(fā)芽過程會(huì)產(chǎn)生游離的氨基酸[9]，但我們實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，常見的18種游離氨基酸（L-亮氨酸、L-脯氨酸、L-異亮氨酸、L-苯丙氨酸、L-醋酸賴氨酸、L-蘇氨酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸、L-組氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸、L-丙氨酸、L-絲氨酸、甘氨酸、L-精氨酸、L-天門冬氨酸、L-鹽酸半胱氨酸、L-谷氨酸）不與該衍生試劑反應(yīng)，對(duì)結(jié)果沒有影響。原因在于這些氨基酸分子中不含酰胺結(jié)構(gòu)。對(duì)那些具有酰胺結(jié)構(gòu)的氨基酸，液相色譜中保留時(shí)間不一致，也對(duì)結(jié)果沒有影響；如常見于西瓜、南瓜中具有酰胺結(jié)構(gòu)的瓜氨酸，其呫噸氫醇的衍生產(chǎn)物與尿素的的保留時(shí)間不同，分別在6.1和9.8 min附近。因此該方法的特異性強(qiáng)，沒有干擾。

2.3 樣品前處理的優(yōu)化

分別試驗(yàn)了水和乙醇做提取溶劑。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用乙醇做提取溶劑，尿素能很好地溶于乙醇，同時(shí)對(duì)含蛋白質(zhì)較高的豆芽可以有助于沉淀蛋白，避免渾濁，降低干擾。在文獻(xiàn)中測定紅酒、尿液、黃酒中的尿素時(shí)衍生試劑采用了正丙醇[7，8]，我們考察了無水乙醇和正丙醇配制衍生試劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響；結(jié)果表明，乙醇作為溶劑時(shí)，尿素衍生產(chǎn)物響應(yīng)值比正丙醇稍高。考慮到樣品處理也采用乙醇提取，因此本文采用無水乙醇作為提取溶劑和配制衍生試劑的溶劑。

2.4 衍生條件的優(yōu)化

2.4.1 鹽酸濃度和用量的影響

試驗(yàn)證實(shí)，不加鹽酸時(shí)，衍生反應(yīng)不發(fā)生，故沒有熒光衍生產(chǎn)物生成。固定衍生試劑和衍生反應(yīng)時(shí)間，我們考察了鹽酸用量對(duì)衍生產(chǎn)物峰面積的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 不同尿素濃度和鹽酸用量條件下衍生產(chǎn)物峰面積的關(guān)系圖Fig.2 Relationship of different urea contents and hydrochloric acid amount on peak areas of derivatives

對(duì)相同濃度的尿素，峰面積隨著鹽酸用量的增加而下降，且下降幅度隨著尿素濃度的升高而增加。因此，為了得到較高的儀器響應(yīng)，應(yīng)減小的用量。分析原因可能部分尿素在酸性條件下與呫噸氫醇發(fā)生競爭反應(yīng)，與鹽酸生成銨離子而分解造成。

2.4.2 衍生時(shí)間的選擇及衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性

在衍生試劑濃度和鹽酸體積不變的條件下，用10 μg/mL的尿素標(biāo)準(zhǔn)液，分別加入10 μL 1.5M稀鹽酸溶液，考察了衍生時(shí)間對(duì)衍生產(chǎn)物峰面積的影響。衍生時(shí)間分別試驗(yàn)了 10、20、60 min 和 1.5、2、3 h 和 5 h，結(jié)果見圖3。

圖3 不同衍生時(shí)間對(duì)衍生產(chǎn)物峰面積的影響Fig.3 Relationship of derivative time on peak areas of derivatives

結(jié)果表明，隨著衍生時(shí)間從10 min到20 min時(shí)，衍生產(chǎn)物快速反應(yīng)，峰面積快速增加，然而增加趨勢從20 min變緩，到2 h時(shí)，能達(dá)到峰值。我們也試驗(yàn)了0.15 M鹽酸條件下，衍生反應(yīng)時(shí)間對(duì)峰面積的變化。發(fā)現(xiàn)峰面積對(duì)相同條件下1.5 M鹽酸的峰面積高3倍以上，但2 h時(shí)衍生反應(yīng)間還在增長，18 h才能達(dá)到穩(wěn)定。為了縮短測試時(shí)間，綜合考慮，最后確定衍生條件用1.5 M鹽酸，鹽酸用量20 μL，衍生時(shí)間2 h。

2.4.3 衍生試劑用量的選擇

當(dāng)保持尿素體積（300 μL）、1.5 M鹽酸溶液用量（20 μL）不變時(shí)，試驗(yàn)了呫噸氫醇用量對(duì)衍生反應(yīng)的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 不同尿素濃度和呫噸氫醇用量條件下衍生產(chǎn)物峰面積的關(guān)系圖Fig.4 Relationship of different urea contents and xanthydrol amounts on peak areas of urea derivatives

尿素濃度分別為2、10、50 μg/mL條件時(shí)，呫噸氫醇用量從10 μL增加至200 μL，衍生產(chǎn)物峰面積逐漸升高，達(dá)到 200 μL～300 μL時(shí)，峰面積可以達(dá)到最大。通過計(jì)算反應(yīng)式（圖1）中呫噸氫醇和尿素的摩爾數(shù)關(guān)系是1∶1；200 μL 4.04 mg/mL 呫噸氫醇的摩爾數(shù)是 4×10-6mol，300 μL 50 μg/mL 尿素的摩爾數(shù)為 2.5×10-7mol。呫噸氫醇用量在200 μL～300 μL時(shí)，物質(zhì)的量過量16倍～24倍，因此該反應(yīng)中呫噸氫醇需要充分過量。本實(shí)驗(yàn)最后確定呫噸氫醇300 μL作為衍生劑用量。

2.5 定性與定量分析

2.5.1 定性分析

在本文建立的色譜條件下，尿素衍生產(chǎn)物保留時(shí)間為9.85 min，峰形對(duì)稱、尖銳，附近沒有干擾峰。尿素標(biāo)準(zhǔn)品和黃豆芽色譜圖見圖5。

圖5 尿素衍生產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)溶液（a）和黃豆芽樣品（b）色譜圖Fig.5 Chromatograms of urea derivative standard（a）and yellow soybean sprout sample（b）

根據(jù)保留時(shí)間定性分析，樣品中目標(biāo)物色譜峰的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)溶液相比在±2.5%的允許偏差之內(nèi)。

2.5.2 線性范圍和檢出限

在建立的色譜條件下對(duì)質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL～50 μg/mL的尿素標(biāo)準(zhǔn)液的衍生產(chǎn)物進(jìn)行測定，以尿素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），衍生產(chǎn)物的峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得到線性回歸方程為Y=120.4X+28.4，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 7。以S/N=3作為本方法的檢出限，本方法檢出限為0.5 mg/kg。

2.5.3 精密度和準(zhǔn)確度

將含尿素7.6 μg/mL黃豆芽溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測定積分峰面積，RSD%為1.5%，說明儀器精密度良好，滿足分析要求。測定自發(fā)綠豆芽尿素含量為3.57 mg/kg；用該樣品進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，加標(biāo)量為10、50、100 μg，即加標(biāo)濃度分別為5、25和50 mg/kg，每個(gè)濃度水平平行測定6次，結(jié)果見表1。

表1 尿素加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 1 Spiked recoveries and RSD%of urea in the samples

加標(biāo)回收率分別為98.5%～106%之間，RSD%在3.2%～4.0%，該方法精密度和準(zhǔn)確度滿足分析要求。

2.6 實(shí)際樣品檢測

選取市售豆芽、綠色食品標(biāo)簽豆芽和自發(fā)豆芽為實(shí)際樣品，按“1.4”條件對(duì)樣品中的尿素進(jìn)行檢測，每個(gè)樣品平行測定兩次，結(jié)果見表2。

表2 豆芽中尿素含量測定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 2 Urea contents in different types of soybean sprouts

結(jié)果發(fā)現(xiàn)自發(fā)豆芽含量在（7.27±4.4）mg/kg（n=6），綠色食品標(biāo)簽豆芽尿素含量（8.1±1.9）mg/kg（n=4）。綠色食品標(biāo)簽豆芽和自發(fā)豆芽結(jié)果相近，兩者之間的差異可能與豆子的品種、發(fā)芽時(shí)間、含水量等因素有關(guān)系。市售散裝豆芽中尿素含量相差較大，從7.6到148mg/kg不等，平均值 49.3±31.5mg/kg（n=35）。自發(fā)豆芽和綠色食品標(biāo)簽豆芽中含有較低含量的尿素，可能來源于豆芽生長過程中蛋白質(zhì)代謝；而尿素含量較高的豆芽有人為添加的嫌疑。進(jìn)一步的研究將確定尿素的本底值與豆的種類、發(fā)芽方法、發(fā)芽時(shí)間之間的關(guān)系。

3 結(jié)論

在酸性條件下9-羥基呫噸和尿素反應(yīng)，可以生成有熒光特性的衍生產(chǎn)物。本文建立了高效液相色譜-熒光檢測法檢測豆芽中的尿素，該法前處理操作簡便快捷，在優(yōu)化的條件下，尿素的檢出限為0.5 mg/kg，加標(biāo)回收率98.5%～106%，且RSD小于4%，可滿足定量分析的需要，方法簡便、靈敏、準(zhǔn)確，適用于豆芽中尿素含量的檢測。

[1]中國進(jìn)出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.SN/T 1004-2001出口蘑菇罐頭中尿素殘留量檢驗(yàn)方法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2001:1-8

[2] 姚永志,左錦靜,金華麗.小麥粉中尿素含量的測定[J].糧食與飼料工業(yè),2010(2):50-52

[3] 陳建華,譚洪濤.丁二酮肟光度法測定牛奶中尿素[J].中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2004,14(4)：462-462

[4]安徽省地方標(biāo)準(zhǔn)安徽省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局.DB34/T1330-2011化妝品中尿素的測定高效液相色譜法[S].安徽科技出版社,2011:1-8

[5] 華曉瑩.液相色譜法檢測土壤中的尿素含量[J].實(shí)驗(yàn)科學(xué)與技術(shù),2008,62：43-45

[6] 王曉娟,傅力,李健飛,等.高校液相色譜測定黃酒中尿素的含量[J].食品工業(yè)科技,2009,30(5)：17-19

[7] Clark S,Francis P S,Conlan X A,et al.Determination of urea using high-performance liquid chromatography with fluorescence detectionafterautomatedderivatisationwithxanthydrol[J].JournalofChromatography A,2007(1161)：207-213

[8] 刑江濤,鐘其頂,熊正河,等.高效液相色譜-熒光檢測器法測定黃酒中尿素含量[J].釀酒科技,2011,201(3)：104-106

[9] Kuo Y,Rozan P,Lambein F,et al.Effects of different germination conditions on the contents of free protein and non-protein amino acids of commercial legumes[J].Food Chemistry,2004,86(2004)：537-545