葛寶坤，楊爽，俞子萱，趙濱巖

（天津出入境檢驗檢疫局，天津300461）

近年來，隨著人們生活水平的提高，葡萄酒已逐漸成為普通百姓餐桌上的重要飲品，但葡萄酒被檢出標簽不合格、重金屬、添加劑超限量使用、生產(chǎn)劣質(zhì)假冒葡萄酒的情況時有發(fā)生[1]，因此葡萄酒的真?zhèn)闻c質(zhì)量的好壞是關(guān)系到人們身體健康的重要因素。葡萄酒的釀造是糖類化合物發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的過程，甘油則是發(fā)酵過程中生成的主要副產(chǎn)物之一，存在于各類葡萄酒中，是干型、半干型葡萄酒的主要組成成分，酒精發(fā)酵過程中多產(chǎn)甘油可使酒味醇和圓潤，是決定葡萄酒質(zhì)量的主要成分[2]，檢測甘油含量可以為鑒定原酒含量、識別摻假酒提供依據(jù)；葡萄酒中的總糖量是影響葡萄酒質(zhì)量和區(qū)分葡萄酒種類的重要指標之一[3]，檢測葡萄酒中含糖量一是了解葡萄汁發(fā)酵的程度，二是測定葡萄酒中含糖量，三是計算出葡萄酒中的干浸出物，根據(jù)GB2760-2011《食品添加劑衛(wèi)生標準》，葡萄酒中不得添加任何形式的糖醇，對葡萄酒進行本地調(diào)查，建立相關(guān)產(chǎn)地葡萄酒中甘油、糖的種類、含量信息庫顯得尤為重要。

目前檢測葡萄酒中甘油和含糖量的方法較多，如氣相色譜法[4]、液相色譜法[5-6]、衍生-GC-MS 法[1]、SPE凈化-液相色譜法[7]、液相色譜-蒸發(fā)光散射法[8]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9-10]、化學(xué)法[11-12]等，但上述方法或存在檢測靈敏度低、或存在操作繁瑣復(fù)雜、或存在檢測成本高、設(shè)備購置昂貴等不足；本法采用30%的乙腈水直接稀釋-液相色譜分離-視差折光檢測器檢測同時測定葡萄酒中甘油、果糖、葡萄糖、蔗糖化合物含量的方法未見報道，實驗研究結(jié)果表明，該方法克服了上述文獻方法中的不足，且具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定、污染小、檢測成本低等特點，便于批量檢測的推廣與應(yīng)用。

1 儀器、試劑及方法

1.1 儀器

e2695高效液相色譜儀（配2414視差遮光檢測器）：Waters公司；MILLI-Q純水儀：MILLIPORE公司；固相萃取柱（型號：SAX；規(guī)格：150 mg/3 mL）：北京迪馬科技公司。

1.2 試劑

乙腈：色譜純；甘油、果糖、葡萄糖、蔗糖（分析純含量≥99%）：天津化學(xué)試劑三廠生產(chǎn)；甘油、糖混合標準儲備液的配制：分別準確稱取一定量的上述標準品，用去離子水溶解、混勻、定容，即為標準儲備液，其中果糖、葡萄糖、蔗糖濃度為20.0 mg/mL，甘油濃度為10 mg/mL；標準使用液是將儲備液用去離子水稀釋至所需要的濃度。

1.3 方法

1.3.1 樣液的制備

取2 mL葡萄酒樣于15 mL離心管中，用30%的乙腈水直接稀釋定容至10 mL，混勻，過0.45 μm濾膜作為甘油、果糖、葡萄糖、蔗糖分離樣液進高效液相色譜儀分析測定。

1.3.2 高效液相色譜條件

色 譜 柱 ：WATERS，ENERGY ANALYSIS NH2，300 mm×3.9 mm，10 μm，或相當(dāng)者；流動相：乙腈+水=80%+20%；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測池溫度：35 ℃；進樣量：10 μL。

1.3.3 分析測定

根據(jù)樣液中被測甘油、糖的含量情況，選定峰面積相近的標準工作液，標準工作液和待測樣液中甘油、糖的響值均應(yīng)在工作曲性范圍內(nèi)，對標準工作液和待測樣液等體積參插進樣測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法的回收率與精密度

在1.3.2的色譜條件下，標準品色譜圖和保留時間見圖1。

圖1 色譜條件下標準品色譜圖Fig.1 Standard chromatograph

取葡萄酒樣品2 mL，按照0.25、2.5、25.0 g/L 3個加標水平，按本方法進行加標回收試驗，并做6個平行樣，結(jié)果為甘油、果糖、葡萄糖、蔗糖的平均回收率均在96%～102%，精密度小于8.0%，本方法的穩(wěn)定性良好，結(jié)果見表1。

2.2 方法的標準曲線及線性關(guān)系

取一定濃度混合標準溶液，用30%的乙腈水分別稀釋成濃度分別為 0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.0、5.0mg/mL，按照本方法色譜條件分析測定，繪制工作曲線，4種成分在0.05 mg/mL～5.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5，結(jié)果見表1。

表1 方法的加標回收率、變異系數(shù)、檢測限（n=10）Table 1 The Recovery，correlation-coefficient，LOD，LOQ（n=10）

2.3 方法的測定限

取葡萄酒樣品約2 mL，加入混合標準溶液2 mL，逐級稀釋后按照本方法色譜條件測定樣品加標結(jié)果，根據(jù)信噪比S/N=10為本方法的定量限（LOQ）、S/N=3為本方法的定性限（LOD）計算出方法的最低檢測限，結(jié)果見表1。

2.4 方法的適用性

為了確定方法的抗干擾能力及適用性，分別選取常見的干紅、干白、甜白、起泡酒、半干高泡葡萄酒樣品，按照本方法條件進行測試，結(jié)果顯示四種待測組分的色譜峰分離度和重現(xiàn)性均較好，樣品中的色素有機酸、揮發(fā)性酚、醛類等成分均不干擾結(jié)果測定。

2.5 稀釋液配比的優(yōu)化

研究了水、甲醇水、乙腈水直接稀釋法對測定結(jié)果的影響，研究表明：甲醇水因含有醇羥基對視差折光檢測器有較大的吸收而影響測試結(jié)果；直接用水稀釋不僅會形成較大的水峰，而且水峰還不能與甘油峰完全分開，造成測試結(jié)果的偏離；另對乙腈水的配比研究還發(fā)現(xiàn)：采用30%的乙腈水直接稀釋樣品可使水峰較小、水峰與甘油的保留時間相差1.0 min、4種待測成分分離較高、基線噪音低，因此，本研究優(yōu)選30%的乙腈水（體積比）為樣品直接稀釋液。

2.6 本方法與GB/T15038-2006中的SPE方法比較

為確定本方法具有簡便、快速、靈敏、成本低的特點，應(yīng)用本方法與國標方法GB/T15038-2006的SPE法，對天津口岸來自美國、法國、意大利、智力、西班牙、羅馬尼亞共16批次的葡萄酒樣品的測試結(jié)果比較發(fā)現(xiàn)，在待測組分含量≤1.0g/L時，SPE方法測定結(jié)果的穩(wěn)定相較差，變異系數(shù)大于10%，待測組分含量≥1.0 g/L時，二者測試結(jié)果的差別無顯著性。因此，直接稀釋法較SPE法更具有操作簡單、快速，不需要SPE凈化柱、試劑消耗少、對環(huán)境污染小等特點。

3 結(jié)果

本文研究的檢測方法4種待測組分在0.05mg/mL～5.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)大于0.999 5；樣品在0.25、2.5、25.0 g/L 3個加標水平內(nèi)的回收率范圍為96%～102%，6次測定的相對標準偏差小于8.0%；方法的定性檢出限（LOD）為0.04 g/L、定量檢出限（LOD）為0.10 g/L，符合色譜分析的方法要求。本研究方法較國標SPE法更具有操作簡單、快速、靈敏、不需要SPE凈化柱、試劑消耗少、對環(huán)境污染小等特點，便于推廣與應(yīng)用。

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