宋春梅，杜鵑，李善姬，劉敏

（吉林醫(yī)藥學(xué)院，吉林 吉林132013）

葡萄籽是葡萄酒廠的下腳料，含有多種營(yíng)養(yǎng)成分和生物活性物質(zhì)，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[1-2]。目前的研究結(jié)果表明，葡萄籽提取物具有抗氧化、清除自由基、抗炎、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病的作用[3-6]。對(duì)于葡萄籽粉的營(yíng)養(yǎng)保健作用研究報(bào)道較少。本文通過對(duì)高脂膳食大鼠肝組織抗氧化能力及肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，為葡萄籽做為天然保健食品提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 葡萄籽粉制備

吉林市市售葡萄籽，磨成粉，過40目篩。

1.2 動(dòng)物分組

wistar雄性大鼠，體重190g～210g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，大鼠購(gòu)回后，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將大鼠按體重隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、高脂模型組、低、中和高劑量葡萄籽粉組，每組12只。分籠飼養(yǎng)，每籠5只，每日自然光照，室溫22℃～25℃。

實(shí)驗(yàn)開始后對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料，其余各組給予高脂飼料喂養(yǎng)。對(duì)照組和高脂組灌胃蒸餾水，低、中和高劑量葡萄籽粉組分別按照標(biāo)準(zhǔn)人劑量20 g/60 kg的1倍、5倍和10倍的葡萄籽粉的量配成不同的濃度進(jìn)行灌胃，連續(xù)灌胃28 d，每周稱體重一次，記錄大鼠的體重，調(diào)節(jié)葡萄籽粉灌胃劑量。

飼料組成：基礎(chǔ)飼料為玉米粉35%、大豆粉30%、面粉25%、麩皮10%，另加多種維生素和無機(jī)鹽。高脂飼料為79%基礎(chǔ)飼料組成，1%膽固醇，10%豬油，10%蛋黃粉。

1.3 儀器和試劑

TD-5A離心機(jī)：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；FA1104N電子天平：上海精密科學(xué)。Hitachi-7650透射電鏡：日立公司；超薄切片機(jī)：徠卡UC7。

SOD和MDA試劑盒：南京建成試劑公司。

1.4SOD活性和MDA含量測(cè)定

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠禁食12h，以10%烏拉坦7mL/kg腹腔麻醉后，打開腹腔，取出肝臟，稱重，制備10%肝組織勻漿液，采用試劑盒測(cè)定SOD和MDA，測(cè)試方法嚴(yán)格按照試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行。

1.5 10%肝組織勻漿液制備

稱取肝組織塊1 g，放到冰冷生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙吸干稱重。加入冷生理鹽水9 g，電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)勻漿，3 000 r/min離心10 min，取上清液，分裝于EP管中，冰箱保存。

1.6 肝臟電鏡標(biāo)本制備

各組隨機(jī)取大鼠4只，將大鼠麻醉，固定在解剖臺(tái)上，開腹暴露肝臟，取同一部位肝組織，用冰生理鹽水漂洗，將其切成1×1×1 mm3組織塊，置于4℃2.5%戊二醛4%多聚甲醛固定液中，1%鋨酸后固定，梯度丙酮脫水，Epon812包埋，徠卡UC7超薄切片機(jī)切片，透射電子顯微鏡Hitachi-7650進(jìn)行觀察照相。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 葡萄籽粉對(duì)大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝系數(shù)的影響

葡萄籽粉對(duì)大鼠體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝系數(shù)的影響見表1。

表1 葡萄籽粉對(duì)大鼠體重、肝重和肝系數(shù)的影響（n=12，±s）Table 1 The effects of grape seed powder on body weight，liver weight and liver index in male rats

表1 葡萄籽粉對(duì)大鼠體重、肝重和肝系數(shù)的影響（n=12，±s）Table 1 The effects of grape seed powder on body weight，liver weight and liver index in male rats

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由表1可知，大鼠喂養(yǎng)4周后體質(zhì)量均有明顯增加，各組大鼠體重均增高，但各組間大鼠體重比較，均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p＞0.05）。高脂模型組肝臟重量和肝指數(shù)均高于對(duì)照組和葡萄籽粉組，各組間相互比較，均無顯著性差異（p＞0.05）。

2.2 葡萄籽粉對(duì)大鼠肝臟SOD活性和MDA含量的影響

葡萄籽粉對(duì)大鼠肝臟SOD活性和MDA含量的影響見表2。

表2 葡萄籽粉對(duì)大鼠肝臟SOD活性和MDA含量的影響（n=8，±s）Table 2 The effects of grape seed powder on the activity of SOD and the contents of MDA in liver tissues of rats

表2 葡萄籽粉對(duì)大鼠肝臟SOD活性和MDA含量的影響（n=8，±s）Table 2 The effects of grape seed powder on the activity of SOD and the contents of MDA in liver tissues of rats

注：與對(duì)照組比較，*p＜0.05，**p＜0.01；與高脂模型組比較，#p＜0.05，##p＜0.01。

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表2結(jié)果表明，高脂模型組和葡萄籽粉各組大鼠SOD活性均高于對(duì)照組，與對(duì)照組比較均有顯著差異（P＜0.05，P＜0.01）；高脂模型組與葡萄籽粉各劑量組比較，葡萄籽粉中和高劑量組有顯著差異（P＜0.05）。MDA含量高脂模型組最高，與對(duì)照組和葡萄籽粉各組比較，均有顯著差異（P＜0.01）。

2.3 葡萄籽粉對(duì)高脂膳食大鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

正常對(duì)照組：肝細(xì)胞呈多邊形，核1個(gè)～2個(gè)，呈圓形，核仁明顯，核內(nèi)常染色質(zhì)多，胞質(zhì)內(nèi)可見豐富的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和糖原顆粒，線粒體嵴清晰，可見少量的溶酶體顆粒。肝細(xì)胞膽小管可見，其腔面有微絨毛，小管兩端的緊密連接清晰，肝細(xì)胞的肝血竇面有微絨毛，小管兩端的緊密連接清晰，血竇內(nèi)皮細(xì)胞呈扁平形，核扁橢圓形，核內(nèi)異染色質(zhì)多（見圖1～圖2）。

圖1 對(duì)照組肝臟電鏡結(jié)構(gòu)×1000Fig.1 Electron microscopic structure of liver tissue of control group×1000

圖2 對(duì)照組肝臟電鏡結(jié)構(gòu)×2000Fig.2 Electron microscopic structure of liver tissue of control group×2000

高脂模型組：肝細(xì)胞體積變小，細(xì)胞的界限不清，核呈圓形，1個(gè)～2個(gè)，核內(nèi)異染色質(zhì)略增多，呈塊狀，核基質(zhì)輕度空化，胞質(zhì)基質(zhì)致密，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)排列緊密，膜增厚，線粒體呈致密狀，嵴不易分清，可見大小不一的圓形脂滴和少量吞噬體。膽小管兩端的緊密連接不易分辨，腔面有微絨毛數(shù)量增多，結(jié)構(gòu)不清晰，肝細(xì)胞血竇面微絨毛結(jié)構(gòu)消失，呈絮狀（見圖3～圖4）。

圖3 高脂模型組肝臟電鏡結(jié)構(gòu)×700Fig.3 Electron microscopic structure of liver tissue of high lipid group×700

圖4 高脂模型組肝臟電鏡結(jié)構(gòu)×2000Fig.4 Electron microscopic structure of liver tissue of high lipid group×2000

葡萄籽粉組：肝細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞界限隱約可見，肝細(xì)胞核圓形，可見雙核，部分肝細(xì)胞的核基質(zhì)呈輕度致密狀，胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)成堆分布，排列緊密；線粒體較多，呈小圓形，嵴呈致密狀?？梢娚⒃诜植嫉奶窃w粒；胞質(zhì)內(nèi)脂滴數(shù)量較高脂模型組略減少，部分肝細(xì)胞胞質(zhì)基質(zhì)呈致密狀。膽小管數(shù)量較多，腔面微絨毛多。肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化較模型組高脂模型組輕（見圖 5～圖 6）。

圖5 葡萄籽粉組肝臟電鏡結(jié)構(gòu)×700Fig.5 Electron microscopic structure of liver tissue of grape seed powder group×700

圖6 葡萄籽粉組肝臟電鏡結(jié)構(gòu)×2000Fig.6 Electron microscopic structure of liver tissue of grape seed powder group×2000

3 討論

在正常生理情況下，機(jī)體內(nèi)源性自由基不斷的產(chǎn)生，產(chǎn)生的自由基可通過體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）等清除，使機(jī)體內(nèi)的自由基保持在低濃度的動(dòng)態(tài)平衡中，通常不會(huì)對(duì)機(jī)體造成損傷。一旦氧自由基產(chǎn)生過多或抗氧化體系出現(xiàn)故障，體內(nèi)氧自由基代謝就會(huì)出現(xiàn)失衡，這就會(huì)引發(fā)脂質(zhì)過氧化。脂質(zhì)過氧化是活性氧自由基損傷機(jī)體的重要途徑之一。大量研究[7]已顯示，高脂膳食能夠使血脂水平升高，脂代謝紊亂，生物體氧化反應(yīng)增強(qiáng)，導(dǎo)致體內(nèi)氧化-抗氧化狀態(tài)失衡，發(fā)生氧化損傷。MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，機(jī)體內(nèi)MDA的水平間接說明了細(xì)胞和組織受損傷的程度。SOD能有效的清除超氧陰離子自由基，代表了機(jī)體的抗氧化能力。本研究結(jié)果表明，中和高劑量葡萄籽粉組SOD活性高于高脂模型組，葡萄籽粉各組MDA含量顯著下降。這表明葡萄籽粉可通過提高酶類抗氧化物質(zhì)來調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平。

高脂飲食導(dǎo)制肝臟脂類代謝異常，產(chǎn)生胰島素抵抗，使胰島素抑制脂肪分解的作用降低，促使脂肪分解加強(qiáng)，游離脂肪酸（FFA）增多，升高的脂肪酸可使肝細(xì)胞線粒體通透性加大并引起腫脹，肝細(xì)胞發(fā)生變性、炎細(xì)胞浸潤(rùn)、甚至壞死等。同時(shí)也可以引起自由基增多，增多的自由基與生物膜的多不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而引起膜結(jié)構(gòu)的改變。研究表明，高脂膳食肝細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)變化：肝細(xì)胞基質(zhì)稀疏，高度脂質(zhì)化，充斥著大量脂肪空泡，線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)紊亂，數(shù)目明顯減少，線粒體嵴大部分融合、消失，核染色質(zhì)凝集[8-9]。本研究證實(shí)，高脂膳食大鼠肝細(xì)胞也有相似的結(jié)構(gòu)變化，補(bǔ)充葡萄籽粉可使肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷減輕。主要是葡萄籽具有降低血脂水平，改善脂代謝紊亂，提高SOD活性，降低MDA含量，保護(hù)肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

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