宋祥晨(綜述)，梁 敏(審校)

(中山大學(xué)光華口腔醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院牙周病科 廣東省口腔醫(yī)學(xué)重點實驗室，廣州 510055)

人的一生中骨組織不斷地進行著改建，骨改建是由骨吸收與骨形成精密控制的生理過程，其中破骨細胞、成骨細胞分別是骨吸收、骨形成的功能細胞[1]。細胞凋亡在胚胎肢體骨發(fā)育、骨改建中發(fā)揮重要作用，其中骨細胞即終末分化的成骨細胞凋亡增多被認為是骨改建活躍的標志；行使骨吸收功能后，破骨細胞迅速發(fā)生凋亡，骨吸收造成的骨陷窩由成骨細胞占據(jù)并形成新骨，隨后部分成骨細胞被骨基質(zhì)包埋轉(zhuǎn)變?yōu)楣且r細胞，其余發(fā)生凋亡。由此可見，成骨細胞、破骨細胞凋亡對骨改建起著重要作用[2]。Bcl-2 interacting mediator of cell death(Bim)是Bcl-2家族促凋亡蛋白成員，介導(dǎo)內(nèi)在凋亡通路的發(fā)生，并廣泛參與健康細胞及腫瘤細胞凋亡[3-5]。該文就Bim在骨改建中的作用進行綜述。

1 細胞凋亡

細胞凋亡是程序性細胞死亡，是受基因調(diào)控的細胞自滅過程，在維持機體正常發(fā)育，穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境，清除腫瘤細胞、自身反應(yīng)性淋巴細胞和微生物感染細胞中具有重要意義。細胞凋亡主要由死亡受體信號通路、線粒體信號通路介導(dǎo)[6]。線粒體信號通路又稱內(nèi)在通路，由Bcl-2家族成員介導(dǎo)[7]。根據(jù)結(jié)構(gòu)與功能的差異，Bcl-2家族成員可分為三種亞型：①含有多個BH域的抗凋亡蛋白，包括Bcl-2、Bcl-xL等；②含有多個BH域的促凋亡蛋白，包括Bak和Bax；③唯BH3域蛋白，包括Bim、Bid、Bad、BNIP3等[8]。唯BH3域蛋白在組織發(fā)育、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定及防治腫瘤中發(fā)揮作用。在外界刺激作用下，唯BH3域蛋白表達增高或活性增強后激活Bak/Bax?；罨腂ak/Bax形成六聚體聚集在線粒體外膜形成孔道，導(dǎo)致細胞色素C的釋放，與凋亡酶激活因子Apaf-1、ATP結(jié)合形成的多聚體募集并活化胱天蛋白酶(caspase)-9，最終激活下游執(zhí)行者caspase-3、caspase-7，導(dǎo)致細胞凋亡[8-9]。

2 Bim的結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能

2.1Bim的發(fā)現(xiàn)及結(jié)構(gòu) Bim是唯BH3域蛋白家族中的一員。O′Connor等[10]于1998年使用32P標簽的Bcl-2蛋白是從T細胞淋巴瘤KO52DA20建立的λ噬菌體cDNA中篩選獲得；同年Hsu等[11]，使用酵母二元雜交從卵巢cDNA中篩選出與髓細胞白血病基因1(Mcl-1)結(jié)合的Bcl-2-related ovarian death agonist(BOD)，證實是Bim的直系同源蛋白質(zhì)。

由于mRNA選擇性剪接的差異，Bim mRNA存在三種亞型：BimEL、BimL、BimS。O′Connor等[10]發(fā)現(xiàn) 3種翻譯后產(chǎn)物BimEL、BimL、BimS均可通過BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2蛋白結(jié)合，其中BimS拮抗Bcl-2的抗凋亡作用最強。Adachi等[12]根據(jù)結(jié)構(gòu)的差異，將后續(xù)發(fā)現(xiàn)的18種Bim亞型分為6組：BimEL、BimL、BimS、BimD、BimDd和BimEDd。其中小鼠BimEL含196個氨基酸，除含有BH3結(jié)構(gòu)域外，還包含2個泛素化位點、3個核糖體蛋白S6激酶磷酸化位點、1個β-transducinrepeats-containingproteins(β-TrCP)結(jié)合模板、3個胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)磷酸化位點和1個c-Jun氨基端激酶磷酸化位點[13]。

2.2Bim的生物學(xué)功能 正常情況下，BimEL/L結(jié)合于微管動力蛋白輕鏈1/動力蛋白輕鏈亞基(LC8)，形成微管動力蛋白復(fù)合體。在凋亡信號刺激下，c-Jun氨基端激酶活化，并磷酸化Bim位于動力蛋白結(jié)合域的Ser56，致Bim與LC8同時從動力蛋白復(fù)合體上釋放，并參與凋亡活動[14]。

Bim可通過直接結(jié)合和間接替代兩種模式激活Bak/Bax。①直接結(jié)合模式：Bim直接與Bak/Bax結(jié)合致其發(fā)生構(gòu)象改變而活化；②間接替代模式：Bim與所有Bcl-2抗凋亡蛋白家族成員均具較高的親和力，故Bim可將Bak/Bax從Mcl-1/Bcl-xL中替代出來而活化[15]。除此之外，Weber等[16]發(fā)現(xiàn)BimS還可直接插入線粒體外膜，致細胞發(fā)生凋亡，而不依賴與Bcl-2/Mcl-1或Bak/Bax的結(jié)合。

2.3Bim在骨改建中的作用及調(diào)節(jié)機制 骨改建過程包括破骨細胞激活期、吸收期、逆轉(zhuǎn)期、成骨細胞成骨期，由基礎(chǔ)多細胞單位完成[17]。基礎(chǔ)多細胞單位含有3種細胞成分：破骨細胞、成骨細胞、骨細胞。細胞凋亡影響成骨細胞與破骨細胞的數(shù)量及功能，從而調(diào)節(jié)骨代謝平衡，而Bim作為細胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，在骨改建中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

2.3.1Bim在破骨細胞中的作用及調(diào)節(jié)機制 骨改建往往由破骨細胞行使骨吸收開始，Bim在破骨細胞凋亡中的作用及調(diào)節(jié)研究較多。Akiyama等[18]發(fā)現(xiàn)，破骨細胞在營養(yǎng)因子(巨噬細胞集落刺激因子)缺乏時迅速凋亡并伴隨Bim表達上調(diào)；而敲除bim基因的破骨細胞，體內(nèi)外存活率均升高。Houde等[19]和Sugatani等[20]通過siRNA干擾破骨細胞bim基因表達后均發(fā)現(xiàn)破骨細胞凋亡減少及存活率增加。Bim在破骨細胞凋亡中的作用機制研究表明，巨噬細胞集落刺激因子、核因子κB受體活化因子配體缺乏時，轉(zhuǎn)化生長因子β可上調(diào)Smad2及p38 Bim表達而誘導(dǎo)破骨細胞凋亡[19]。Matsumoto等[21]證實，含氮二磷酸利塞膦酸鹽經(jīng)內(nèi)在凋亡通路上調(diào)Bim表達來誘導(dǎo)破骨細胞凋亡，而對敲除bim基因(bim-/-)小鼠及轉(zhuǎn)染促分裂原活化的蛋白激酶激酶1的破骨細胞無凋亡作用。以上研究提示，Bim在破骨細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。

Bim除在破骨細胞凋亡中發(fā)揮作用外，對破骨細胞骨吸收能力也有影響。Akiyama等[18]發(fā)現(xiàn)與野生型(bim+/+)相比，bim-/-的小鼠破骨細胞，其骨吸收能力降低，同時bim-/-小鼠可出現(xiàn)輕微的骨質(zhì)硬化；而bim-/-的破骨細胞轉(zhuǎn)染bimL后細胞存活率降低，同時伴有骨吸收能力恢復(fù)。Bcl-2家族抗凋亡成員Bcl-xL的相關(guān)研究[23]表明，過表達Bcl-xL/SV40 T抗原基因的小鼠破骨細胞，其宿主小鼠同樣出現(xiàn)骨質(zhì)硬化現(xiàn)象；Iwasawa等[24]進一步發(fā)現(xiàn)，Bcl-xL可通過降低細胞外基質(zhì)的分泌而減弱破骨細胞的骨吸收能力，因此推測促凋亡蛋白Bim與Bcl-2家族抗凋亡蛋白之間的平衡對骨代謝至關(guān)重要。

大量研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細胞、神經(jīng)細胞、心肌細胞凋亡中Bim存在基因水平、蛋白合成水平及蛋白合成后水平等多層次調(diào)節(jié)，而Bim在破骨細胞凋亡中的調(diào)節(jié)主要是蛋白合成后水平的調(diào)節(jié)[4,25-29]。Akiyama等[18]、Wakeyama等[30]和Bradley等[31]相繼證實破骨細胞凋亡中bim mRNA表達并未發(fā)生改變，但Akiyama等[18]發(fā)現(xiàn)Bim在破骨細胞中受c-Cbl介導(dǎo)的泛素化蛋白酶體降解調(diào)控。Bradley等[31]研究同樣證實轉(zhuǎn)錄因子EGR-2可通過上調(diào)c-Cbl表達降解Bim。Purev等[32]進一步證實，敲除破骨細胞c-Cbl、Cbl-b基因可顯著上調(diào)Bim表達并誘導(dǎo)破骨細胞凋亡，同時破壞細胞偽足小體及微管系統(tǒng)，推斷Cbl家族可通過調(diào)節(jié)細胞支架影響B(tài)im的泛素化降解。針對破骨細胞凋亡中Bim的調(diào)節(jié)機制，Sugatani等[20]、Wakeyama等[30]先后發(fā)現(xiàn)破骨細胞中存在mTOR-Bim、Caspase-Bim負反饋調(diào)控。Matsumoto等[21]對利塞膦酸鹽骨保護機制的研究顯示，破骨細胞敲除bim及轉(zhuǎn)染促分裂原活化的蛋白激酶激酶1均可抑制利塞膦酸鹽的破骨細胞凋亡誘導(dǎo)作用，但無法抑制利塞膦酸鹽的骨保護作用，而只有轉(zhuǎn)染蛋白激酶B(Akt)能夠促進骨吸收；利塞膦酸鹽在bim-/-小鼠中起著與野生型小鼠相同的骨保護作用：證實ERK/Bim通路調(diào)控小鼠破骨細胞凋亡，而Akt通路可能通過細胞骨架調(diào)控破骨細胞骨吸收。

2.3.2Bim在成骨細胞中的作用及調(diào)節(jié)機制 成骨細胞形成新骨是骨改建的完成階段。成骨細胞凋亡在骨改建過程中同樣發(fā)揮作用，而Bim是成骨細胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子[33]。Espina等[34]證實，生理狀態(tài)下小鼠前成骨細胞系小鼠骨髓間質(zhì)細胞中促凋亡蛋白Bim表達很低，高濃度腎上腺皮質(zhì)激素作用24～48 h后Bim的表達增高，同時伴有大量細胞凋亡，且隨著腎上腺皮質(zhì)激素作用時間及濃度的增加，Bim的表達及細胞凋亡也隨之上調(diào)；siRNA干擾bim表達可降低小鼠骨髓間質(zhì)細胞凋亡比例。血清饑餓致成骨細胞凋亡機制的研究進一步證實Bim在介導(dǎo)成骨細胞凋亡過程中起關(guān)鍵作用[35]。Kawamura等[36]在血清饑餓誘導(dǎo)小鼠前成骨細胞MC3T3-E1凋亡中同樣證實，Bim表達呈時間依賴性升高，而Bax、Bcl-2及Bcl-xL表達均未發(fā)生改變；siRNA干擾bim后活化的胱天蛋白酶3表達也隨之降低。以上研究說明，Bim介導(dǎo)成骨細胞凋亡。

Bim在成骨細胞凋亡中存在多水平調(diào)節(jié)。Espina等[34]證實，血清饑餓從基因水平上調(diào)成骨細胞Bim mRNA表達。Kawamura等[36]進一步對Bim基因水平調(diào)節(jié)的研究表明，叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子O3a結(jié)合bim啟動子后可啟動其轉(zhuǎn)錄，增強轉(zhuǎn)錄活性，而Akt1可通過磷酸化叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子O3a、阻止其核轉(zhuǎn)移而抑制bim轉(zhuǎn)錄活性及成骨細胞凋亡，另一方面敲除Akt1(Akt1-/-)的成骨細胞叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子O3a磷酸化減弱、核轉(zhuǎn)移降低、成骨細胞凋亡率下降。Purev等[32]同樣發(fā)現(xiàn)ERK/蛋白激酶B抑制Bim mRNA及蛋白表達，推斷ERK/蛋白激酶B通路下調(diào)Bim基因表達。Guo等[37]敲除成骨細胞miR-17～92a可促進地塞米松誘導(dǎo)的成骨細胞凋亡，而過表達miR-17～92a可加強雌激素對成骨細胞的抗凋亡作用，進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-17～92a可與Bim 3′-非翻譯區(qū)域結(jié)合而抑制Bim表達。Liang等[35]在成骨細胞凋亡中發(fā)現(xiàn)Bim受蛋白水平調(diào)節(jié)。蛋白合成后，蛋白酶體抑制劑MG132可顯著上調(diào)成骨細胞Bim的表達，提示Bim受蛋白酶體的降解調(diào)控[35]。

3 小 結(jié)

骨改建包括骨形成與骨吸收，兩者的平衡對骨穩(wěn)態(tài)十分重要。目前的研究已證實，除在破骨細胞凋亡中發(fā)揮重要作用外，Bim對破骨細胞的骨吸收能力也有一定的影響，但具體機制尚不清楚。Bim在破骨細胞凋亡中存在c-Cbl介導(dǎo)的泛素化蛋白酶體降解調(diào)控，但基因水平及蛋白合成水平調(diào)控目前尚未證實。與破骨細胞相比，生理狀態(tài)下成骨細胞中Bim的表達很低；而在腎上腺素、血清饑餓等刺激下，Bim表達上調(diào)并伴有細胞凋亡。Bim同樣介導(dǎo)成骨細胞凋亡并存在多水平、多層次調(diào)節(jié)。

[1] 于世鳳.骨吸收與骨形成[J].現(xiàn)代康復(fù),2001,5(2):10-13.

[2] Stevens HY,Reeve J,Noble BS.Bcl-2,tissue transglutaminase and p53 protein expression in the apoptotic cascade in ribs of premature infants[J].J Anat,2000,196(Pt 2):181-191.

[4] Suzuki S,Yokoyama U,Abe T,etal.Differential roles of epac in regulating cell death in neuronal and myocardial cells[J].J Biol Chem,2010,285(31):24248-24259.

[5] Mao H,Gu H,Qu X,etal.Involvement of the mitochondrial pathway and Bim/Bcl-2 balance in dihydroartemisinin-induced apoptosis in human breast cancer in vitro[J].Int J Mol Med,2013,31(1):213-218.

[6] Duprez L,Wirawan E,Vanden Berghe T,etal.Major cell death pathways at a glance[J].Microbes Infect,2009,11(13):1050-1062.

[8] Lomonosova E,Chinnadurai G.BH3-only proteins in apoptosis and beyond:an overview[J].Oncogene,2008,27 Suppl 1:S2-S19.

[9] Letai A,Bassik MC,Walensky LD,etal.Distinct BH3 domains either sensitize or activate mitochondrial apoptosis,serving as prototype cancer therapeutics[J].Cancer Cell,2002,2(3):183-192.

[10] O′Connor L,Strasser A,O′Reilly LA,etal.Bim:a novel member of the Bcl-2 family that promotes apoptosis[J].EMBO J,1998,17(2):384-395.

[11] Hsu SY,Lin P,Hsueh AJ.BOD(Bcl-2-related ovarian death gene) is an ovarian BH3 domain-containing proapoptotic Bcl-2 protein capable of dimerization with diverse antiapoptotic Bcl-2 members[J].Mol Endocrinol,1998,12(9):1432-1440.

[12] Adachi M,Zhao X,Imai K.Nomenclature of dynein light chain-linked BH3-only protein Bim isoforms[J].Cell Death Differ,2005,12(2):192-193.

[13] Akiyama T,Tanaka S.Bim:guardian of tissue homeostasis and critical regulator of the immune system,tumorigenesis and bone biology[J].Arch Immunol Ther Exp(Warsz),2011,59(4):277-287.

[14] Puthalakath H,Huang DC,O′Reilly LA,etal.The proapoptotic activity of the Bcl-2 family member Bim is regulated by interaction with the dynein motor complex[J].Mol Cell,1993,3(3):287-296.

[15] Willis SN,Chen L,Dewson G,etal.Proapoptotic Bak is sequestered by Mcl-1 and Bcl-xl,but not Bcl-2,until displaced by BH3-only proteins[J].Genes Dev,2005,19(11):1294-1305.

[16] Weber A,Paschen SA,Heger K,etal.BimS-induced apoptosis requires mitochondrial localization but not interaction with anti-apoptotic Bcl-2 proteins[J].J Cell Biol,2007,177(4):625-636.

[17] Doll B,Aleef M,Hollinger JO.Overview of fracture repair[M]//Pietrzak WS.Musculoskeletal Tissue Regeneration:Humana Press,2008:39-61.

[18] Akiyama T,Bouillet P,Miyazaki T,etal.Regulation of osteoclast apoptosis by ubiquitylation of proapoptotic BH3-only Bcl-2 family member Bim[J].EMBO J,2003,22(24):6653-6664.

[19] Houde N,Chamoux E,Bisson M,etal.Transforming growth factor-beta1(TGF-beta1) induces human osteoclast apoptosis by up-regulating Bim[J].J Biol Chem,2009,284(35):23397-23404.

[20] Sugatani T,Hruska KA.Akt1/Akt2 and mammalian target of rapamycin/Bim play critical roles in osteoclast differentiation and survival,respectively,while Akt is dispensable for cell survival in isolated osteoclast precursors[J].J Biol Chem,2005,280(5):3583-3589.

[21] Matsumoto T,Nagase Y,Iwasawa M,etal.Distinguishing the proapoptotic and antiresorptive functions of risedronate in murine osteoclasts:role of the Akt pathway and the ERK/Bim axis[J].Arthritis Rheum,2011,63(12):3908-3917.

[22] Miyazaki T,Katagiri H,Kanegae Y,etal.Reciprocal role of ERK and NF-kappaB pathways in survival and activation of osteoclasts[J].J Cell Biol,2000,148(2):333-342.

[23] Hentunen TA,Reddy SV,Boyce BF,etal.Immortalization of osteoclast precursors by targeting Bcl-XL and Simian virus 40 large T antigen to the osteoclast lineage in transgenic mice[J].J Clin Invest,1998,102(1):88-97.

[24] Iwasawa M,Miyazaki T,Nagase Y,etal.The antiapoptotic protein Bcl-xL negatively regulates the bone-resorbing activity of osteoclasts in mice[J].J Clin Invest,2009,119(10):3149-3159.

[25] Ha Thi HT,Lim HS,Kim J,etal.Transcriptional and post-translational regulation of Bim is essential for TGF-β and TNF-α-induced apoptosis of gastric cancer cell[J].Biochim Biophys Acta,2013,1830(6):3584-3592.

[26] Xie B,Wang C,Zheng Z,etal.Egr-1 transactivates Bim gene expression to promote neuronal apoptosis[J].J Neurosci,2011,31(13):5032-5044.

[27] Yao M,Nguyen TV,Pike CJ.Estrogen regulates Bcl-w and Bim expression:role in protection against β-amyloid peptide-induced neuronal death[J].J Neurosci,2007,27(6):1422-1433.

[28] Lelièvre EC,Plestant C,Boscher C,etal.N-cadherin mediates neuronal cell survival through Bim down-regulation[J].PLoS One,2012,7(3):e33206.

[29] Qian L,Van Laake LW,Huang Y,etal.miR-24 inhibits apoptosis and represses Bim in mouse cardiomyocytes[J].J Exp Med,2011,208(3):549-560.

[30] Wakeyama H,Akiyama T,Takahashi K,etal.Negative feedback loop in the Bim-caspase-3 axis regulating apoptosis and activity of osteoclasts[J].J Bone And Miner Res,2007,22(10):1631-1639.

[31] Bradley EW,Ruan MM,Oursler MJ.Novel pro-survival functions of the kruppel-like transcription factor Egr2 in promotion of macrophage colony-stimulating factor-mediated osteoclast survival downstream of the MEK/ERK pathway[J].J Biol Chem,2008,283(12):8055-8064.

[32] Purev E,Neff L,Horne WC,etal.c-Cbl and Cbl-b act redundantly to protect osteoclasts from apoptosis and to displace HDAC6 from beta-tubulin,stabilizing microtubules and podosomes[J].Mol Biol Cell,2009,20(18):4021-4030.

[33] Hock JM,Krishnan V,Onyia JE,etal.Osteoblast apoptosis and bone turnover[J].J Bone Miner Res,2001,16(6):975-984.

[34] Espina B,Liang M,Russell RG,etal.Regulation of bim in glucocorticoid-mediated osteoblast apoptosis[J].J Cell Physiol,2008,215(2):488-496.

[35] Liang M,Russell G,Hulley PA.Bim,Bak,and Bax regulate osteoblast survival[J].J Bone Miner Res,2008,23(5):610-620.

[36] Kawamura N,Kugimiya F,Oshima Y.Akt1 in osteoblasts and osteoclasts controls bone remodeling[J].PLoS ONE,2007,2(10):e1058.

[37] Guo L,Xu J,Qi J,etal.MicroRNA-17-92a upregulation by estrogen leads to Bim targeting and inhibition of osteoblasts apoptosis.[J].J Cell Sci,2013,126(Pt 4):978-988.