王海峰，陳 文，劉艷艷，吳王澤

(1.菏澤醫(yī)學(xué)專(zhuān)科學(xué)校，山東菏澤274000;2.武漢市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢430014)

大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)及鑒定

王海峰1，陳 文1，劉艷艷1，吳王澤2

(1.菏澤醫(yī)學(xué)專(zhuān)科學(xué)校，山東菏澤274000;2.武漢市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖北武漢430014)

目的 培養(yǎng)符合實(shí)驗(yàn)要求的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)并進(jìn)行鑒定。方法 采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)大鼠BMSCs，對(duì)細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)特性進(jìn)行觀察，并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞表面抗原CD29、CD34、CD45、CD90表型進(jìn)行鑒定。結(jié)果 BMSCs呈貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞形態(tài)以梭形為主，有時(shí)可見(jiàn)少量呈多角形，細(xì)胞平行排列生長(zhǎng)或渦旋狀生長(zhǎng);BMSCs高表達(dá)干細(xì)胞表面抗原CD29、CD90，而低表達(dá)造血干細(xì)胞表面抗原CD34、CD45。結(jié)論 全骨髓貼壁法培養(yǎng)BMSCs既簡(jiǎn)單又經(jīng)濟(jì)，通過(guò)多次傳代可以達(dá)到細(xì)胞純化的目的，對(duì)細(xì)胞的性狀影響較小。

脊髓損傷;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞;細(xì)胞表面抗原

脊髓損傷是一類(lèi)嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的致殘性疾病，由于神經(jīng)系統(tǒng)的不可再生性，迄今為止，國(guó)內(nèi)外已進(jìn)行的脊髓損傷治療均未取得滿(mǎn)意的臨床療效。近年來(lái)，隨著干細(xì)胞工程的推進(jìn)，干細(xì)胞移植成為治療脊髓損傷的研究熱點(diǎn)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)打破了神經(jīng)干細(xì)胞的局限性，成為干細(xì)胞移植治療脊髓損傷的新型“種子細(xì)胞”。本文旨在采用全骨髓貼壁法培養(yǎng)大鼠BMSCs，觀察細(xì)胞的貼壁情況和生長(zhǎng)特點(diǎn)，并采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，觀察細(xì)胞表面抗原CD29、CD34、CD45、CD90的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠，SPF級(jí)，鼠齡30 d左右，體質(zhì)量250～300 g，由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，合格證號(hào):SCXK(鄂)2008-0005。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠BMSCs的分離與培養(yǎng)［1－3］取1月齡Wistar大鼠，斷頸處死;嚴(yán)格無(wú)菌條件下取雙側(cè)后肢股骨和脛骨，去除骨表面的肌肉組織，Hanks液沖洗，剪去骨骺端，暴露骨髓腔;用5 mL的無(wú)菌注射器吸取Hanks液沖洗骨髓腔，收集沖出的骨髓細(xì)胞，反復(fù)吹打制成單細(xì)胞懸液;然后接種在T25的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。首次換液時(shí)間第3 d，以后每3 d換1次。待細(xì)胞融合達(dá)到時(shí)70%開(kāi)始傳代。

1.2.2 BMSCs表面抗原檢測(cè) 體外分離培養(yǎng)的BMSCs經(jīng)過(guò)質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%Tryspin-EDTA消化，常規(guī)處理后Hanks液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×1010·L－1;取100 μL樣本分別加入以下抗體:CD29-PE/cy5、CD34-FITC、CD45-FITC、CD90-PE(冰上操作)。加入抗體的細(xì)胞冰上放置15～30 min，Hanks液洗1次，500 μL Hanks液重懸細(xì)胞;流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3 BrdU標(biāo)記細(xì)胞的免疫熒光 標(biāo)記原理:5－溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)為胸腺嘧啶的衍生物，在細(xì)胞S期可替代胸腺嘧啶摻入到合成的DNA中。腹腔注射BrdU或細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)加入BrdU，然后利用抗BrdU抗體，細(xì)胞免疫熒光染色顯示BrdU可以作為一種細(xì)胞標(biāo)記物［4］。BrdU作為一種嘧啶類(lèi)似物，其標(biāo)志方法簡(jiǎn)單，不存在放射性污染，而且BrdU標(biāo)志的細(xì)胞只要不受到紫外線的照射，對(duì)細(xì)胞就沒(méi)有功能損害［4－7］。當(dāng)細(xì)胞處于DNA合成期而同時(shí)又有BrdU存在時(shí)，就會(huì)有BrdU摻入到新合成的DNA中，只要細(xì)胞不凋亡，這種BrdU就在細(xì)胞核的DNA中長(zhǎng)期存留。細(xì)胞準(zhǔn)備:將培養(yǎng)的細(xì)胞按適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N于6孔板內(nèi)，6孔板的每個(gè)孔都有預(yù)先放入的無(wú)菌蓋玻片。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)4 d后分別在細(xì)胞移植前24、8 h加入BrdU，BrdU的終濃度為10 μmol·L－1。免疫熒光:將6孔板從培養(yǎng)箱拿出來(lái)?xiàng)壢ヅ囵B(yǎng)基，PBS洗3次，每次5 min;加入固定液(乙酸∶甲醇為1∶3)，立即吸干凈倒掉，再加入適量的固定液，－20℃放置20～30 min;PBS洗3次，每次5 min。12 mol·L－1HCl溶液37℃變性1 h，吸掉HCl溶液，PBS洗3次，每次5 min。免疫反應(yīng):用自配的抗體封閉液封閉30～60 min，棄去封閉液，將一抗Antibody-BrdU(mouse fraction，1∶1 000稀釋)加入6孔板內(nèi)，37℃40～60 min或4℃過(guò)夜;PBS洗3次，每次5 min;二抗Anti-mouse IgG-FITC(1∶800稀釋)加入，室溫避光1～2 h;PBS洗3次，每次5 min;抗熒光衰減封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

圖1 BMSCs培養(yǎng)的形態(tài)學(xué)觀察(×100)

2.1 BMSCs的細(xì)胞形態(tài)觀察 細(xì)胞接種24 h后，呈現(xiàn)貼壁性生長(zhǎng)。72 h后更換新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，大部分呈梭形，但有時(shí)可見(jiàn)呈三角形。培養(yǎng)2周左右貼壁細(xì)胞迅速增殖成簇生長(zhǎng)或漩渦狀生長(zhǎng)，隨著傳代和細(xì)胞優(yōu)勢(shì)的自然選擇可以得到純化。見(jiàn)圖1。

2.2 BMSCs的表面抗原鑒定 流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示:通過(guò)對(duì)不同代數(shù)的BMSCs的檢測(cè)可以看出BMSCs高表達(dá)CD90、CD29，而低表達(dá)CD34、CD45。

BMSCs第1代的鑒定結(jié)果如下，流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs表面抗原的表達(dá)率分別是:CD90 95.4%、CD29 97.2%、CD34 27.7%、CD45 27.7%。

BMSCs第2代的鑒定結(jié)果如下，流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs表面抗原的表達(dá)率分別是:CD90 92.6%、CD29 98.5%、CD34 9.0%、CD45 9.0%。

BMSCs第4代的鑒定結(jié)果如下，流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs表面抗原的表達(dá)率分別是:CD90 93.1%、CD29 96.3%、CD34 4.5%、CD45 4.5%。

BMSCs第9代的鑒定結(jié)果如下，流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs表面抗原的表達(dá)率分別是:CD90 99.5%、CD29 100.0%、CD34 1.8%、CD45 4.6%。

2.3 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)BrdU標(biāo)記的BMSCs 移植前24 h在培養(yǎng)的BMSCs中加入BrdU，細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)目的細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察:細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，DAPI標(biāo)志的細(xì)胞核呈藍(lán)色;BrdU標(biāo)志的細(xì)胞核呈綠色。DAPI標(biāo)志的藍(lán)色細(xì)胞核與BrdU標(biāo)志的綠色細(xì)胞核的大部分融合在一起，證明BrdU可以作為BMSCs的標(biāo)志物。見(jiàn)圖2。

DAPI能快速進(jìn)入細(xì)胞并能融入細(xì)胞DNA，因此DAPI可以用于標(biāo)志活體細(xì)胞。在細(xì)胞增殖期，BrdU可以替代脫氧核苷酸而且可以隨著DNA的傳代而繼續(xù)存在。因此，DAPI染色和BrdU染色可以顯示細(xì)胞的位置。DAPI標(biāo)志的細(xì)胞核顯示藍(lán)色，BrdU標(biāo)志的細(xì)胞核顯示綠色。

3 討論

BMSCs具有高度的自我更新能力和多向分化潛能，是細(xì)胞治療和基因治療的理想靶細(xì)胞。骨髓中BMSCs的含量非常少，每10萬(wàn)個(gè)單核細(xì)胞中大約只有1個(gè)BMSC［8－9］，且隨著年齡的增長(zhǎng)細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，如此微量的BMSCs難以滿(mǎn)足治療的需要。因此，尋找適宜的BMSCs體外分離、擴(kuò)增、純化的方法，對(duì)于進(jìn)一步研究BMSCs的生物學(xué)特性尤為重要。目前常用的方法主要有4種:全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、細(xì)胞表面抗原標(biāo)志分選法、細(xì)胞篩選法，其中以全骨髓貼壁法和密度梯度離心法最為常用。全骨髓貼壁法即根據(jù)干細(xì)胞貼壁特性，定期換液除去不貼壁細(xì)胞，從而達(dá)到純化BMSCs的目的。隨著對(duì)BMSCs表面抗原認(rèn)識(shí)的深入，利用免疫方法如流式細(xì)胞術(shù)、免疫磁珠等方法對(duì)其進(jìn)行分離純化，但經(jīng)過(guò)上述方法分選后的細(xì)胞出現(xiàn)了增殖緩慢等一些問(wèn)題，加之耗費(fèi)較大和技術(shù)難度高，在某種程度上限制了這些方法的廣泛應(yīng)用。而全骨髓貼壁法和密度梯度離心法雖然不如后2種方法獲取的細(xì)胞純度高，可是經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)細(xì)胞仍然可以得到純化，而且方法簡(jiǎn)單，細(xì)胞活性較高，成本低，步驟簡(jiǎn)單，細(xì)胞被污染的機(jī)會(huì)小，因此不管是從技術(shù)上還是經(jīng)濟(jì)上都是分離BMSCs的理想方法。

圖2 BrdU標(biāo)志BMSCs情況(×400)

BMSCs與造血干細(xì)胞、其他來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞以及神經(jīng)干細(xì)胞等一樣，是干細(xì)胞中的多能干細(xì)胞，其不僅能自身復(fù)制，而且可以“橫向分化”為各種組織細(xì)胞，F(xiàn)riedenstein等［10］首先發(fā)現(xiàn)了BMSCs的貼壁生長(zhǎng)特性。本實(shí)驗(yàn)就是利用其貼壁生長(zhǎng)特性來(lái)分離培養(yǎng)BMSCs，用培養(yǎng)基沖出大鼠骨髓后直接置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，骨髓中的BMSCs會(huì)貼附于培養(yǎng)瓶底生長(zhǎng)，然后更換培養(yǎng)基逐步除去漂浮生長(zhǎng)的造血系細(xì)胞，這樣BMSCs便可以逐步得到純化。此時(shí)還有部分淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞與BMSCs一起貼壁生長(zhǎng)。淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞貼壁較牢固，由于BMSCs在胰蛋白酶作用下容易脫離培養(yǎng)瓶底部，在傳代時(shí)嚴(yán)格控制酶的量和消化時(shí)間，保證在短暫的作用時(shí)間內(nèi)與培養(yǎng)瓶底分開(kāi)，從而進(jìn)一步純化BMSCs［11］。本實(shí)驗(yàn)采取全骨髓貼壁培養(yǎng)法對(duì)大鼠BMSCs進(jìn)行分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增，所培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)多呈梭形、呈集落生長(zhǎng)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［12］。

大鼠骨髓取材的方法雖然很簡(jiǎn)單，但是一定要注意無(wú)菌操作，否則容易造成污染而影響細(xì)胞的培養(yǎng)。取材中一般要準(zhǔn)備2套無(wú)菌器械，一套是用來(lái)分離股骨與脛骨，另一套則是用來(lái)在超凈工作臺(tái)中收集細(xì)胞。為了盡量避免凝血，本實(shí)驗(yàn)采用頸椎脫臼法處死大鼠，然后將大鼠在酒精中浸泡5 min。首先用一套器械去除皮膚和肌肉，再在超凈工作臺(tái)中用另一套器械打開(kāi)骨髓腔沖出骨髓細(xì)胞，這樣就可大大減少污染的機(jī)會(huì)，整個(gè)取材過(guò)程所用的時(shí)間越短越好。

BMSCs的表面抗原并不是獨(dú)特的，其既有間質(zhì)細(xì)胞的表面抗原特征，又具有內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和肌肉細(xì)胞的表面抗原特征，因此到目前為止并未找到非常特異性的BMSCs標(biāo)志分子。一般認(rèn)為，CD29、CD44、CD166、CD105等是BMSCs的重要標(biāo)志物［13］，而B(niǎo)MSCs不表達(dá)造血干細(xì)胞表面抗原，如造血前體細(xì)胞標(biāo)志抗原CD34、成熟造血細(xì)胞標(biāo)志抗原CD38、白細(xì)胞標(biāo)志抗原CD45、淋巴細(xì)胞表面抗原CD11a和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞表面抗原CD14。因?yàn)锽MSCs目前還沒(méi)有公認(rèn)的獨(dú)特抗原表型［14］，故本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)及CD29、CD34、CD45、CD90 4種表面標(biāo)志抗原來(lái)鑒定BMSCs。本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的表面標(biāo)記，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明培養(yǎng)的細(xì)胞高表達(dá)CD29、CD90而低表達(dá)CD34、CD45，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)的細(xì)胞即非造血干細(xì)胞，也非成纖維細(xì)胞，而是不同于造血干細(xì)胞的另一大類(lèi)的干細(xì)胞，即BMSCs，與文獻(xiàn)［15］報(bào)道一致。

細(xì)胞移植首先遇到的問(wèn)題是如何標(biāo)志移植的細(xì)胞，進(jìn)而跟蹤其存活、生長(zhǎng)、分化的過(guò)程，移植細(xì)胞的標(biāo)志及對(duì)其在活體內(nèi)的跟蹤是此類(lèi)研究中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)?，F(xiàn)在用于細(xì)胞標(biāo)志的方法主要有同位素標(biāo)志、熒光標(biāo)志、超順磁標(biāo)志、BrdU標(biāo)志及原位雜交檢測(cè)等［16－22］。本實(shí)驗(yàn)采用BrdU標(biāo)志，BrdU是一種嘧啶類(lèi)似物，其尿嘧啶的堿基嘧啶環(huán)中與5位C原子連接的甲基被溴代替。當(dāng)細(xì)胞處于DNA合成期而同時(shí)又有BrdU存在時(shí)，就會(huì)有BrdU摻入到新合成的DNA中，只要細(xì)胞不凋亡，這種BrdU在細(xì)胞核的DNA中會(huì)長(zhǎng)期存留。與同位素和熒光標(biāo)記技術(shù)相比較，BrdU抗體不與胸腺嘧啶發(fā)生交叉反應(yīng)，沒(méi)有放射性，經(jīng)免疫組織化學(xué)染色即可觀察BrdU在細(xì)胞內(nèi)的摻入情況，避免了假陽(yáng)性。適量的BrdU標(biāo)記只要不受到紫外線的照射，一般不會(huì)產(chǎn)生大的毒副反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化無(wú)明顯影響［7，23］。BrdU對(duì)細(xì)胞毒性小，檢測(cè)的特異性高、標(biāo)志率高，而且實(shí)驗(yàn)過(guò)程迅速簡(jiǎn)便、安全，故其是反映細(xì)胞增殖及跟蹤監(jiān)測(cè)移植細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化的理想指標(biāo)［24－26］。

4 結(jié)論

綜上所述，得出結(jié)論:1)BMSCs的分離方法包括全骨髓貼壁法、密度梯度離心法、細(xì)胞表面抗原標(biāo)志分選法和細(xì)胞篩選法。由于后2種的方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，現(xiàn)在主要采用前兩者;2)細(xì)胞表面標(biāo)志CD29和CD90，表達(dá)率高達(dá)90%，而低表達(dá)造血干細(xì)胞的表面標(biāo)志CD34和CD45，經(jīng)過(guò)多次傳代后BMSCs得以純化;3) BrdU摻入到細(xì)胞DNA中作為細(xì)胞標(biāo)記，對(duì)細(xì)胞損害作用較小，而且可以長(zhǎng)期留在細(xì)胞內(nèi)，有利于細(xì)胞移植以后檢測(cè)移植細(xì)胞在脊髓內(nèi)的情況。

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Isolation，Cultivation and Identification of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells of Rats

Wang Haifeng1，Chen Wen1，Liu Yanyan1，Wu Wangze2
(1.Heze Medical College，Heze 274000，China; 2.Department of Medical Laboratory，the Central Hospital of Wuhan，Wuhan 430014，China)

ObjectiveTo culture and identify the rat marrow mesenchymal stem cells(BMSCs)fitting the requirement of experimentation.MethodsWhole bone marrow adherent culture method in vitro was used to culture the BMSCs of rats in vitro，the morphology and characteristics of the cells was observed，the phenotypes of CD29，CD34，CD45 and CD90 were identified by flow cytometry.ResultsBMSCs stuck wall growth in good condition，cells in a spindle primarily forms into fiber cell sample growth，sometimes visible small amounts of a polygonal cells，parallel arrangement growth or vortex shape growth.High expression of stem cell surface molecular(CD29 and CD90)and low expression of hematopoietic stem cell surface molecular(CD34 and CD45)were observed in the BMSCs.ConclusionWhole bone marrow adherent culture method is simple and economical BMSCs culture method，the purified cells can be achieved through the passage，and the method has the little effect on cell trait.

spinal cord injury;bone marrow mesenchymal stem cells;cell surface antigen

10.3969/j.issn.1673-5412.2014.02.002

R329

A

1673－5412(2014)02－0097－05

王海峰(1987－)，女，碩士，主要從事腫瘤病因?qū)W的研究。E-mail:luckydogwang@163.com

2013－02－06)