周萬(wàn)，周向東，尤列·皮爾曼，維克多·科羅索夫

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶400010；2.俄羅斯醫(yī)學(xué)科學(xué)院遠(yuǎn)東呼吸生理與病理中心，布拉戈維申斯克675000）

OGR1籍ERK信號(hào)通路參與酸性微環(huán)境致氣道上皮細(xì)胞黏蛋白5AC表達(dá)

周萬(wàn)1，周向東1，尤列·皮爾曼2，維克多·科羅索夫2

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科，重慶400010；2.俄羅斯醫(yī)學(xué)科學(xué)院遠(yuǎn)東呼吸生理與病理中心，布拉戈維申斯克675000）

目的探討氣道酸性微環(huán)境誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞黏蛋白5AC表達(dá)的上游信號(hào)通路調(diào)節(jié)機(jī)制。方法體外培養(yǎng)人氣道上皮細(xì)胞（16HBE），以氯化氫創(chuàng)造細(xì)胞酸性環(huán)境（pH 6.4），以細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）特異性抑制劑PD88059及卵巢癌G蛋白耦聯(lián)受體1（OGR1）siRNA進(jìn)行干預(yù)，將細(xì)胞隨機(jī)分為8組：對(duì)照組、酸刺激組、酸刺激+轉(zhuǎn)染OGR1siRNA組、pH 7.4+OGR1 siRNA組、酸刺激+陰性siRNA組、pH 7.4+陰性siRNA組、酸刺激+PD98059組、pH 7.4+PD98059組。采用RT-PCR、ELISA法分別觀察細(xì)胞黏蛋白（MUC）5AC轉(zhuǎn)錄水平及培養(yǎng)上清液中MUC5AC蛋白水平的改變；Western blot法檢測(cè)OGR1蛋白及p-ERK蛋白的相對(duì)含量。結(jié)果酸刺激組內(nèi)細(xì)胞MUC5AC轉(zhuǎn)錄及蛋白水平顯著高于對(duì)照組（P值均＜0.05），其OGR1及p-ERK蛋白含量較對(duì)照組亦明顯增加，酸刺激+轉(zhuǎn)染OGR1siRNA組MUC5AC mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白水平顯著低于酸刺激組（P值均＜0.05），其p-ERK含量亦明顯降低。而pH 7.4+OGR1siRNA組MUC5AC蛋白含量及mRNA水平較pH7.4對(duì)照組無(wú)明顯差別，其p-ERK含量也變化不大。酸刺激+PD98059組MUC5AC mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白水平顯著低于酸刺激組（P值均＜0.05），而pH 7.4+PD98059組較對(duì)照組MUC5AC mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白水平無(wú)明顯差異。結(jié)論OGR1可能通過(guò)激活ERK信號(hào)通路參與氣道酸性微環(huán)境所致的人氣道黏膜上皮細(xì)胞MUC5AC表達(dá)。

黏蛋白；酸性環(huán)境；卵巢癌G蛋白耦聯(lián)受體1；細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶

氣道黏液高分泌是諸如慢性阻塞性肺疾病、哮喘等慢性氣道炎癥性疾病的重要病理特征［1］，大量研究結(jié)果顯示慢性氣道炎癥性疾病多導(dǎo)致氣道微環(huán)境酸化，而持久的氣道酸性微環(huán)境進(jìn)一步加重氣道黏液高分泌，其最主要的病理性表達(dá)產(chǎn)物是氣道黏蛋白（mucin，MUC）5AC［2］，但酸暴露下參與這一過(guò)程的具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑尚有待明確。國(guó)外研究報(bào)道，G蛋白耦聯(lián)受體家族中卵巢癌G蛋白耦聯(lián)受體1（ovarian cancer G protein-coupled receptor 1，OGR1）作為一種質(zhì)子敏感型受體，目前被眾多研究證實(shí)參與酸性環(huán)境刺激下細(xì)胞信號(hào)調(diào)節(jié)通路。而細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extra cellular signal-regulated kinase，ERK）［3］作為多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的匯總點(diǎn)，有報(bào)道顯示參與了其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。鑒于ERK在氣道黏蛋白5AC高表達(dá)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中居重要地位。故此，我們推測(cè)氣道在酸性環(huán)境下激活OGR1可引起ERK活化，從而誘導(dǎo)MUC5AC病理性高表達(dá)。本研究旨在進(jìn)一步探討氣道酸性環(huán)境下黏蛋白5AC過(guò)度表達(dá)的上游關(guān)鍵信號(hào)調(diào)節(jié)途徑及其在氣道黏液高分泌中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人支氣管氣道上皮細(xì)胞（16HBE）購(gòu)自ATCC（美國(guó)），DMEM培養(yǎng)液、HEPES、Trizol、胎牛血清、抗β-actin單克隆抗體、ERK特異性抑制劑PD98059（Sigma，美國(guó)），OGR1siRNA和對(duì)照siRNA（吉?jiǎng)P，中國(guó)），小鼠抗MUC5AC單克隆抗體（45MI）（NeoMarkers，美國(guó)），兔抗磷酸化ERK多克隆抗體、HRP-羊抗兔抗體、HRP-羊抗小鼠抗體（Santa Cruz，美國(guó)），人MUC5AC ELISA試劑盒（R&D system，美國(guó)），F(xiàn)u-GENE6試劑（Roche，美國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

于6孔板中培養(yǎng)16HBE細(xì)胞，每孔（5～6）×105個(gè)細(xì)胞，加入2 mL DMEM培養(yǎng)液（含10%牛胎血清，鏈霉素（100 μg/mL），青霉素（100 μg/mL），HEPES（25 mmol/L），37℃，5%CO2培養(yǎng)箱孵育，常規(guī)換液培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞達(dá)70%～80%融合時(shí)傳代，將細(xì)胞分為8組，對(duì)照組：無(wú)胎牛血清無(wú)雙抗的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，給予適宜濃度氯化氫使維持pH 7.4；pH 6.4組：細(xì)胞于無(wú)血清培養(yǎng)液、pH6.4培養(yǎng)；pH 6.4+OGR1siRNA組（轉(zhuǎn)染OGR1 siRNA后，于無(wú)血清培養(yǎng)液、pH6.4培養(yǎng)）；pH 6.4+siRNA陰性對(duì)照組（以陰性siRNA轉(zhuǎn)染后于無(wú)血清培養(yǎng)液；pH6.4培養(yǎng)）；pH 7.4+OGR1 siRNA組（以O(shè)GR1 siRNA轉(zhuǎn)染后于無(wú)血清培養(yǎng)液；pH7.4培養(yǎng)）；siRNA陰性對(duì)照組（以陰性siRNA轉(zhuǎn)染后，無(wú)血清培養(yǎng)液；pH7.4培養(yǎng)；pH 6.4+PD98059組（細(xì)胞給予ERK抑制劑PD98059 50 μmol/L后，無(wú)血清培養(yǎng)液；pH6.4培養(yǎng)）；pH 7.4+ PD98059組（細(xì)胞給予ERK抑制劑PD98059 50 μmol/L后，無(wú)血清培養(yǎng)液、pH7.4培養(yǎng)）。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（n=5），實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.3 MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活力

在96孔板里加入200 μL細(xì)胞懸液，每孔細(xì)胞密度約l×104/mL。每組8個(gè)復(fù)孔，分別在8、16、24及36 h時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

OGR1siRNA試劑由中國(guó)吉?jiǎng)P生物化學(xué)有限公司合成，OGR1 siRNA序列為5′-CAA UUC AGG UUC CUC GCC G（dTdT）-3′，陰性siRNA序列為5′-GCG CGC UUU GUA GGA UUC G（dTdT）-3′。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞調(diào)整濃度至（1～2）×109/L，孵育12 h，當(dāng)細(xì)胞融合達(dá)30%～50%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，操作步驟按FuGENE6說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以陰性siRNA為陰性對(duì)照，轉(zhuǎn)染后24～48 h后進(jìn)行細(xì)胞處理并行相關(guān)檢測(cè)。

1.5 ELISA法測(cè)上清液MUC5AC蛋白含量吸取培養(yǎng)基上清液，40℃包被96孔酶標(biāo)反應(yīng)板，干燥，PBS清洗酶標(biāo)板3次，2%小牛血清室溫封閉1 h，加入小鼠單克隆MUC5AC抗體（1∶100，用含0.05%Tween-20的PBST稀釋50 μL），孵育1 h；洗滌3次，加入辣根過(guò)氧化物酶-羊抗小鼠IgG（1∶10 000）孵育1 h；四甲基聯(lián)苯胺過(guò)氧化物酶溶液顯色，1 mol/L H2SO4終止反應(yīng)后測(cè)各孔A值（λ=450 nm），與標(biāo)準(zhǔn)品比較而得到黏蛋白MUC5AC的相對(duì)值。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測(cè)MUC5AC mRNA

采用Trizol法分別提取各組細(xì)胞內(nèi)的總RNA，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，測(cè)RNA在260 nm和280 nm的吸光度（A）值，樣品A260/A280比值均介于1.8～2.0，根據(jù)260 nm的A值對(duì)樣品的總RNA初步定量，保存于-20℃?zhèn)溆?。隨后以兩步法行RTPCR。參照MMLV第一鏈cDNA合成試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA第一鏈。MUC5AC的PCR引物序列（由生工生物工程有限公司提供）上游5′GAGGGCCCAGTGA GCATCTCC 3′，下游5′TGGGA-

CAGCAGCAGTATTCAGT 3′。滅菌PCR管中依次加入MgCl2（25 mmol/L）4.0 μL、10×PCR反應(yīng)緩沖液5.0 μL、上下游引物各1.0 μL、dNTP 4.0 μL、cDNA 2.0 μL，Taq酶（5 U/μL）0.5 μL，定容至50.0 μL，輕輕混勻離心后行PCR擴(kuò)增。于94℃預(yù)變性10 min，后緊隨30個(gè)循環(huán)，循環(huán)參數(shù)：94℃30 s，57℃45 s，70℃45 s，后72℃延伸7 min補(bǔ)齊末端。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，約540 bp處為目的基因片段。電泳結(jié)果經(jīng)光密度面積積分分析，以與βactin mRNA的比值作為目的基因mRNA的相對(duì)含量。

1.7 Western印跡分析相關(guān)蛋白含量

細(xì)胞加入冰預(yù)冷的裂解液，冰浴20 min，4℃12 000 r/min離心15 min，取上清液經(jīng)8%聚丙烯酰胺（SOS）凝膠電泳分離，印跡轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，于5%BSA中封閉1 h后，分別加入兔抗磷酸化ERK多克隆抗體（1∶1 000）和兔抗OGR1多克隆抗體（1∶500）4℃過(guò)夜，洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的第二抗體（1∶10 000），37℃孵育1 h。徹底洗滌后經(jīng)增敏化學(xué)發(fā)光法顯色，加入底物與反應(yīng)液后，顯色5 min。結(jié)果經(jīng)光密度面積積分分析，以與內(nèi)參照βactin產(chǎn)物條帶的比值作為相對(duì)含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析，多組數(shù)據(jù)間差異分析采用多組間單因素方差分析，兩組間單因素分析采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測(cè)各組細(xì)胞活力

各組細(xì)胞在同一時(shí)間點(diǎn)吸光度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）。

表1 各組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)增殖活力的比較Tab.1 The cellular proliferation activity of 16HBE at different time

表1 各組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)增殖活力的比較Tab.1 The cellular proliferation activity of 16HBE at different time

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2.2 轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞表達(dá)情況的鑒定

Western blot結(jié)果顯示OGR1siRNA轉(zhuǎn)染后其表達(dá)蛋白明顯減少，提示轉(zhuǎn)染成功（圖1）。

圖1 Western blot檢測(cè)OGR1沉默效率Fig.1 The expression of the OGR1 receptor in 16HBE cells measured by Western blot

2.3 各實(shí)驗(yàn)組MUC5AC mRNA轉(zhuǎn)錄水平及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MUC5AC分泌水平

給予培養(yǎng)液細(xì)胞維持pH值為6.4的酸性微環(huán)境后，與對(duì)照組相比，其MUC5AC mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯上升（t=-33.67，P=0.000），而轉(zhuǎn)染OGR1siRNA后幾乎完全阻斷酸暴露下上調(diào)的MUC5AC轉(zhuǎn)錄水平（t=18.06，P=0.000），而轉(zhuǎn)染陰性siRNA組與對(duì)照組相比MUC5AC mRNA轉(zhuǎn)錄水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t=-0.02，P=0.490）；未給予酸刺激的對(duì)照組分別與pH 7.4+陰性siRNA組、pH 7.4+OGR1siRNA組比較MUC5AC mRNA轉(zhuǎn)錄水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（t值分別為-0.46、0.38；P值分別為0.330、0.350）（表2）。細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的MUC5AC蛋白分泌水平與MUC5AC mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化一致（表2）。

2.4 酸性刺激及PD98059預(yù)處理對(duì)p-ERK及MUC5AC蛋白含量及mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響

pH 6.4+PD98059預(yù)處理后p-ERK含量（圖2）、MUC5AC蛋白含量及mRNA轉(zhuǎn)錄水平較pH 6.4組顯著降低（t=16.75，P=0.000），而pH 7.4+PD98059組的p-ERK含量（圖2）、MUC5AC蛋白含量及mRNA轉(zhuǎn)錄水平與pH 7.4對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.75，P=0.238）（表2）。

表2 各組細(xì)胞MUC5AC轉(zhuǎn)錄水平及培養(yǎng)上清中MUC5AC分泌水平Tab.2 The expression of MUC5AC protein and MUC5AC mRNA in 16HBE cells

表2 各組細(xì)胞MUC5AC轉(zhuǎn)錄水平及培養(yǎng)上清中MUC5AC分泌水平Tab.2 The expression of MUC5AC protein and MUC5AC mRNA in 16HBE cells

Compared with pH 7.4 control group：1）P＜0.05；compared with pH 6.4 group：2）P＜0.05.

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圖2 酸刺激及PD98059預(yù)處理對(duì)ERK磷酸化水平的影響Fig.2 The effect of acidic stimulation and PD98059 on the phosphorylation level of ERK

2.5 酸刺激及轉(zhuǎn)染OGR1siRNA對(duì)p-ERK蛋白含量影響

pH 6.4+OGR1siRNA組與pH 6.4組相比ERK的磷酸化水平明顯下降，MUC5AC蛋白含量及水平也明顯降低（P＜0.05），而pH 7.4+OGR1siRNA組p-ERK含量、MUC5AC蛋白及mRNA水平較對(duì)照組無(wú)明顯影響，但均明顯低于酸預(yù)處理組（P＜0.05）（圖3，表2）。

圖3 酸刺激及轉(zhuǎn)染OGR1siRNA對(duì)ERK磷酸化水平的影響Fig.3 The effect of acidic stimulation and OGR1 siRNA on the phosphorylation level of ERK

3 討論

氣道酸性微環(huán)境是慢性氣道炎癥時(shí)小氣道的普遍表現(xiàn)，正常人氣道微環(huán)境pH在7.5～7.7，但慢性氣道炎性疾病諸如哮喘患者氣道微環(huán)境pH值多在5.2～7.1之間［4］，故本實(shí)驗(yàn)選擇pH 6.4中間值作為對(duì)照研究，許多研究已經(jīng)表明質(zhì)子敏感型離子通道包括對(duì)酸刺激及辣椒素敏感的瞬時(shí)感受器陽(yáng)離子通道［5］等在酸誘導(dǎo)的各種病理生理表現(xiàn)如氣道狹窄、氣道高反應(yīng)性、高分泌中扮演了重要的角色，但是目前對(duì)于氣道酸環(huán)境所致的各種病理性改變信號(hào)通路機(jī)制仍不清楚。

質(zhì)子敏感G蛋白耦聯(lián)受體家族，包括誘導(dǎo)細(xì)胞停滯于G2/M期的G蛋白耦聯(lián)受體G2A（G2 accumulation）、T細(xì)胞死亡耦聯(lián)基因8（T cell death associated gene 8，TDAG8）、G蛋白耦聯(lián)受體4（G protein coupled receptor 4 GPR4）及OGR1，在人體組織細(xì)胞中廣泛分布，但只有OGR1和GPR4高表達(dá)于肺組織中。該類(lèi)受體能通過(guò)組氨酸殘基感知胞外質(zhì)子或pH值的變化［6］，從而介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路。有研究提示OGR1在pH7.4～7.6范圍內(nèi)即可被激活，而進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在pH6.4～6.8范圍可被充分激活［7］。國(guó)外報(bào)道質(zhì)子敏感型受體OGR1可介導(dǎo)氣道酸性微環(huán)境所致的氣道平滑肌收縮［8］、氣道重塑，還可刺激IL-6的產(chǎn)生，而IL-6作為前炎性因子，在哮喘氣道炎性反應(yīng)中起重要作用［9］，研究表明OGR1還可通過(guò)OGR1/Gq/PLC信號(hào)通路介導(dǎo)［Ca2+］依賴的MUC5AC出胞［10］。故OGR1在氣道炎性疾病導(dǎo)致的各種病理生理改變有重要作用，可能是酸性環(huán)境下MUC5AC mRNA高表達(dá)的上游信號(hào)調(diào)節(jié)的重要靶點(diǎn)，并在氣道黏液高分泌的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

本研究顯示酸暴露下氣道MUC5AC mRNA及其蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)，而轉(zhuǎn)染OGR1siRNA后明顯

降低由酸性微環(huán)境所致的氣道MUC5AC mRNA及其蛋白含量，較未給予酸暴露的對(duì)照組相比差異明顯，此研究結(jié)果與國(guó)外在其他系統(tǒng)的研究結(jié)論相同，證實(shí)了OGR1可能是氣道上皮細(xì)胞接收酸刺激信號(hào)的重要膜靶點(diǎn)，其在接收酸刺激信號(hào)后進(jìn)一步向胞內(nèi)傳導(dǎo)，從而引發(fā)氣道酸性微環(huán)境下的黏液高分泌。

ERK是多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的共同匯總點(diǎn)，已有報(bào)道低pH環(huán)境下可誘導(dǎo)人A431細(xì)胞ERK磷酸化增強(qiáng)［11］。在胃食管返流患者中，食管低pH環(huán)境可增強(qiáng)ERK的表達(dá)，促進(jìn)食管細(xì)胞的增殖［12］。目前已公認(rèn)ERK在各種因素誘導(dǎo)的氣道MUC5AC高表達(dá)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中居重要地位。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在酸性微環(huán)境中p-ERK表達(dá)明顯增強(qiáng)，給予其特異性抑制劑PD98059后ERK的活化減弱，且實(shí)驗(yàn)中MUC5AC mRNA及其蛋白含量也明顯降低，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染OGR1siRNA的實(shí)驗(yàn)組中p-ERK含量明顯降低，說(shuō)明抑制OGR1的表達(dá)能降低p-ERK的水平，提示酸暴露下ERK的激活有賴于OGR1的作用。上述研究結(jié)果表明，OGR1能通過(guò)活化ERK誘導(dǎo)MUC5AC mRNA及其蛋白的高表達(dá)，從而參與酸暴露所致的黏液高分泌形成過(guò)程。

綜上所訴，本研究探討了酸暴露下氣道MUC5AC mRNA及其蛋白高表達(dá)的上游信號(hào)分子，提示OGR1/ERK途徑可能是其主導(dǎo)信號(hào)通路，研究結(jié)果進(jìn)一步完善了對(duì)慢性氣道炎癥時(shí)黏液高分泌形成機(jī)制的認(rèn)識(shí)，也提供了一個(gè)可能有現(xiàn)實(shí)意義的干預(yù)靶點(diǎn)。

［1］Hogg J C，Chu F，Utokaparch S，et al.The nature of small-airway obstruction in chronic obstructive pulmonary disease［J］.N Engl J Med，2004，350（26）：2645-2653.

［2］Turner J，Jones CE.Regulation of mucin expression in respiratory diseases［J］.Bioche Soc Trans，2009，37（4）：877.

［3］Hewson CA，Edbrooke MR，Johnston SL.PMA induces the MUC5AC respiratory mucin in human bronchial epithelial cells，via PKC，EGF/TGF-alpha，Ras/Raf，MEK，ERK and Sp1-dependent mechanisms［J］.J Molecular Biol，2004，344：683-695.

［4］Jayaraman S，Song Y，Verkman AS.Airway surface liquid pH in well -differentiated airway epithelial cell cultures and mouse trachea［J］. Am J Physiol Cell Physiol，2001，281（5）：C1504-C1511.

［5］Faisy C，Planquette B，Naline E，et al.Acid-induced modulation of airway basal tone and contractility：role of acid-sensing ion channels（ASICs）and TRPV1 receptor［J］.Life Sci，2007，81（13）：1094-1102.

［6］Yu H，Li Q，Zhou X，et al.Transient receptor potential vanilloid 1 receptors mediate acid‐induced mucin secretion via Ca2+influx in human airway epithelial cells［J］.J Biochem Mol Toxicol，2012，26（5）：179-186.

［7］Tomura H，Mogi C，Sato K，et al.Proton-sensing and lysolipid-sensitive G-protein-coupled receptors：a novel type of multi-functional receptors［J］.Cell Signal，2005，17（12）：1466-1476.

［8］Saxena H，Deshpande DA，Tiegs BC，et al.The GPCR OGR1（GPR68）mediates diverse signalling and contraction of airway smooth muscle in response to small reductions in extracellular pH［J］.Bri J Pharmacol，2012，166（3）：981-990.

［9］Ichimonji I，Tomura H，Mogi C，et al.Extracellular acidification stimulates IL-6 production and Ca2+mobilization through protonsensing OGR1 receptors in human airway smooth muscle cells［J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2010，299（4）：L567-L577.

［10］Liu C，Li Q，Zhou X，et al.Regulator of G-protein signaling 2 inhibits acid-induced mucin5AC hypersecretion in human airway epithelial cells［J］.Respir Physiol Neurobiol，2013，185（2）：265-271.

［11］Xue L，Lucocq JM.Low extracellular pH induces activation of ERK 2，JNK，and p38 in A431 and Swiss 3T3 cells［J］.Biochem Biophys Res Commun，1997，241（2）：236-242.

［12］Souza RF，Shewmake K，Terada LS，et al.Acid exposure activates the mitogen-activated protein kinase pathways in Barrett's esophagus［J］.Gastroenterology，2002，122（2）：299-307.

（編輯 裘孝琦）

Study of OGR1/ERKMediated Mechanism for the Acid-induced Mucin 5ACExpression and Secretion in Human Airway Epithelial Cells

ZHOUWan1，ZHOU Xiang-dong1，Juliy M.Perelman2，VictorP.Kolosov2
（1.Department of Respiratory Medicine，The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400010，China；2.Far Eastern Scientific Center ofPhysiology and Pathology ofRespiration，Siberian Branch，Russian Academy ofMedicalSciences，Blagoveshchensk 675000，Russia）

ObjectiveTo explore the related signal transduction mechanism in acid-induced expression of MUC5AC mRNA by airway epithelial cells.Methods16HBE cells were stimulated by hydrogen chloride，and treated with OGR1siRNA and an inhibitors to ERK（PD98059）.Cells were divided into 8 groups：the control group（pH 7.4），the acidic stimulation group（pH 6.4），the acidic stimulation+OGR1siRNA group，the pH 7.4+OGR1siRNA group，the acidic stimulation+control siRNA group，the pH 7.4+control siRNA group，the acidic stimulation+PD98059 group，and the pH 7.4+PD98059 group.The transcription level of mucin（MUC）5AC was evaluated with reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）.The MUC5AC secreted in supernatant was measured by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）.The expression of OGR1 protein and the protein levels of phosphorylation extracellular signal-regulated kinase（p-ERK）were measured by Western blot.ResultsThe expression of MUC5AC mRNA and MUC5AC protein levels were remarkably higher in the acidic stimulation group compared with those in the control group（P＜0.05）.The expression of OGR1and p-ERK protein also significantly increased.The expression of MUC5AC mRNA and MUC5AC protein levels in the acidic stimulation+OGR1siRNA group were also significantly lower than those in the control group and its p-ERK decreased remarkably.There is no significant difference in expression of MUC5AC mRNA and mRNA level between the control group and p-ERK also showed no significant change after transfection of OGR1siRNA.The secretion level of MUC5AC and the expression of MUC5AC mRNA were much lower in the acidic stimulation+PD98059 group than in the acidic stimulation group（P＜0.05），while there were no significant difference between the control group and the pH 7.4+PD98059 group in the secretion levelofMUC5AC and expression of MUC5AC mRNA（P＞0.05）.ConclusionOGR1/ERK transduction cascade may be uppersignalregulatorsin acid-induced MUC5ACexpression in 16HBE cells.

MUC5AC；acidic stimulation；ovarian cancer G protein-coupled receptor 1；extra cellular signal-regulated kinase

R310.17

A

0258-4646（2014）02-0122-05

國(guó)家自然科學(xué)基金（81370111）；國(guó)家自然科學(xué)基金中俄國(guó)際合作項(xiàng)目（31211120168）

周萬(wàn)（1988-），男，碩士，研究生.

周向東，E-mail：zxd999@263.net

2013-11-12

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