尚超，洪楊，郭艷，薛一雪

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物教研室，沈陽(yáng) 110001；2.附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽(yáng) 110004；3.附屬口腔醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng)110002）

腦膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)腫瘤，約占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的60%，具有惡性程度高、侵襲能力強(qiáng)等特性［1］。腦膠質(zhì)瘤患者即使經(jīng)手術(shù)及術(shù)后放化療等治療手段的積極干預(yù)，死亡率仍高達(dá)98%以上，2年生存率僅為20%。因此，加強(qiáng)對(duì)腦膠質(zhì)瘤的病因?qū)W研究尤為迫切［2］。

本研究組的前期研究發(fā)現(xiàn)，MACC1基因在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)明顯上調(diào)，是腦膠質(zhì)瘤潛在的癌基因［2］。但MACC1表達(dá)上調(diào)的原因尚不清楚。本研究擬應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR?143和MACC1基因在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，并研究miR?143在腦膠質(zhì)瘤中對(duì)MACC1表達(dá)的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象：37例腦膠質(zhì)瘤及相應(yīng)的癌旁組織均來源于2011年4月15日至2012年11月7日期間中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科住院患者。男22例，女15例，年齡45～62歲，中位年齡56.2歲。

人腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞系由中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)提供。

1.1.2 主要試劑：miRNA分離試劑盒及miRNA檢測(cè)試劑盒 All?in?OneTMmiRNA qRT?PCR Detection Kit購(gòu)自Genecopoeia公司。pre?miR?143、anti?miR?143及control miRNA購(gòu)自Ambion公司。轉(zhuǎn)染試劑Transmessenger購(gòu)自Qiagen公司。引物由上海生工公司合成?？筂ACC1抗體購(gòu)自Abcam公司。West?ern blot相關(guān)試劑購(gòu)自上海碧云天公司。熒光素酶活性檢測(cè)系統(tǒng)Dual?Luciferase Reporter System購(gòu)自Promega公司。野生型MACC1 3′非翻譯區(qū)（3′un?translation region，3′UTR）熒光素酶載體 pGL3?MACC1 3′UTR?Wt（Wt.UTR）及突變型MACC1 3′UTR熒光素酶載體pGL3?MACC1 3′UTR?Mut（Mut.UTR）由Invitrogen公司提供。

1.2 方法

1.2.1 miR?143表達(dá)的檢測(cè)：待測(cè)組織標(biāo)本經(jīng)液氮冷凍粉碎，應(yīng)用mirVanaTMmiRNA isolation試劑盒提取總microRNA，應(yīng)用All?in?OneTMmiRNA qRT?PCR Detection Kit對(duì)獲取的microRNA的3′端進(jìn)行加“Poly A”處理，然后將Poly A化的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以U6為內(nèi)參基因，參照試劑盒說明書擴(kuò)增miR?143基因。應(yīng)用ABI公司的7500 Real?time PCR儀，7500 Software v2.0軟件。采用比較CT值法（2-ΔΔCT法）對(duì)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行相對(duì)定量分析。計(jì)算公式：（1）改變的倍數(shù)＝2-ΔΔCT；（2）ΔΔCT＝ΔCT腫瘤組-ΔCT癌旁組；（3）ΔCT＝CT靶基因-CT內(nèi)參。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將U87細(xì)胞接種在6孔板中（5×104個(gè)/孔），培養(yǎng)24 h。1 mg的microRNA與試劑盒中的Enhanser R試劑混合，再與4 μL TransMessenger試劑混合，獲得的混合物加入900 μL無血清培養(yǎng)基后用于孵育待轉(zhuǎn)染的U87細(xì)胞，2 h后吸去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，然后用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組：以未轉(zhuǎn)染的U87細(xì)胞為空白對(duì)照組（C1）；以轉(zhuǎn)染control miRNA的U87細(xì)胞為陰性對(duì)照組（C2）；以轉(zhuǎn)染pre?miR?143的U87細(xì)胞為pre?miR?143組（pre?miR?143）；以轉(zhuǎn)染anti?miR?143的U87細(xì)胞為anti?miR?143組（anti?miR?143）。

1.2.4 Western blot：提取待測(cè)細(xì)胞蛋白，Bradford法進(jìn)行定量。蛋白樣品上樣后，經(jīng)SDS?PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、ECL發(fā)光和成像等步驟后獲得圖像結(jié)果。經(jīng)GDS凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，MACC1的灰度值與內(nèi)參蛋白GAPDH的灰度值的比值即為MACC1蛋白表達(dá)的相對(duì)值。

1.2.5 熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)分析：將microRNAs及重組載體共轉(zhuǎn)染腦膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞。分組如下：A組：pre?miR?143+Wt.UTR；B組：miR?143 control+Wt.UTR；C組：pre?miR?143+Mut.UTR；D組：miR?143 control+Mut.UTR。應(yīng)用雙熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)（Dual?LueiferaseReporterSystem）檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞熒光素酶活性，步驟如下：棄培養(yǎng)液，PBS漂洗2次；加入1×PLB裂解液20 μL，常溫振蕩裂解15 min；加入LARⅡ溶液100 μL，雙報(bào)告系統(tǒng)熒光素酶檢測(cè)儀讀取熒光值；加入Stop溶液100 μL，再次讀取熒光值；計(jì)算相對(duì)熒光值。計(jì)算公式：相對(duì)熒光值=螢火蟲熒光素酶熒光值/海腎熒光素酶熒光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)以明確資料的總體分布類型，正態(tài)分布數(shù)據(jù)用±s表示。樣本呈正態(tài)分布且方差齊的多組間差異比較應(yīng)用單因素方差分析，再用LSD?t檢驗(yàn)做兩兩比較。2組獨(dú)立樣本均值比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)腦膠質(zhì)瘤組織中miR?143和MACC1的表達(dá)

通過引物溶解曲線分析，miR?143和MACC1基因均擴(kuò)增成功。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果經(jīng)比較CT值法分析進(jìn)行相對(duì)定量，miR?143在腦膠質(zhì)瘤和癌旁組織中的ΔCT分別為6.043±0.427與5.216±0.418，ΔΔCT為0.827，腦膠質(zhì)瘤組織中miR?143的表達(dá)明顯下調(diào)，為癌旁組織中miR?143表達(dá)量的56.37%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.01）。

MACC1 mRNA在腦膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織中的ΔCT分別為 3.438±0.415與 4.834±0.463，ΔΔCT為-1.396，腦膠質(zhì)瘤組織中MACC1 mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)，為癌旁組織中MACC1 mRNA表達(dá)量的263.17%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.01）。

2.2 miR?143和MACC1表達(dá)的相關(guān)性分析

對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR獲取的miR?143和MACC1表達(dá)的數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)分析，2者表達(dá)的相關(guān)系數(shù)為-0.792，證實(shí)miR?143和MACC1的表達(dá)在腦膠質(zhì)瘤中呈顯著的負(fù)相關(guān)。

2.3 pre miR?143和 anti?miR?143對(duì) U87細(xì)胞中MACC1蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示：C1組、C2組、pre?miR?143組和anti?miR?143組均呈現(xiàn)清晰條帶（圖1）。4組細(xì)胞中MACC1蛋白的相對(duì)表達(dá)量分別為1.364±0.079、1.348±0.076、0.683±0.065和2.146±0.087。C1組和C2組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與對(duì)照組相比，pre?miR?143組中MACC1蛋白表達(dá)顯著降低，而anti?miR?143組中MACC1蛋白表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.05）。

圖1 pre?miR?143和anti?miR?143對(duì)U 87細(xì)胞中M A C C 1蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Influenceofpre?miR ?143 andanti?miR ?143 ontheexpressionofM A C C 1 proteininU 87 cells

2.4 熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)分析

應(yīng)用共轉(zhuǎn)染技術(shù)將不同組合的pre?miR?143、miR?143 control、野生型表達(dá)載體Wt.UTR和突變型表達(dá)載體Mut.UTR轉(zhuǎn)染到U87細(xì)胞中，結(jié)果表明共轉(zhuǎn)染pre miR?143和Wt.UTR的報(bào)告基因活性相對(duì)于其他對(duì)照組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.05）（圖2）。

圖2 熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)分析驗(yàn)證miR?143對(duì)M A C C 1基因的調(diào)控Fig.2 R egulatoryeffectofmiR?143 onM A C C 1 geneasverified byluciferasereportergeneexpressionanalysis

3 討論

本研究組在前期研究中發(fā)現(xiàn)：腦膠質(zhì)瘤組織中MACC1基因表達(dá)顯著上調(diào)，而且應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默了U87細(xì)胞中MACC1基因后，結(jié)果顯示MACC1基因沉默的U87細(xì)胞的增殖活力降低，凋亡率顯著增強(qiáng)［2］。提示MACC1基因在腦膠質(zhì)瘤中可能作為癌基因存在，但MACC1表達(dá)上調(diào)的原因尚不清楚。

microRNAs（miRNAs）是一類非編碼的小分子RNA，長(zhǎng)度為19～25個(gè)核苷酸。miRNAs主要通過與靶基因mRNA 3′UTR的完全或不完全配對(duì)，引起mRNA降解或翻譯抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)［3］。miRNAs能夠通過調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)和功能從而參與調(diào)控個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞凋亡、增殖及分化等生命活動(dòng)［4，5］。我們應(yīng)用 miRBase等生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)miR?143能夠與MACC1基因的3′UTR結(jié)合。miR?143基因定位于5q32，在乳腺癌和腎癌等惡性腫瘤中呈現(xiàn)顯著的表達(dá)降低［6～8］，而且能夠通過靶向抑制CD44v3的表達(dá)進(jìn)而抑制非小細(xì)胞肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移［9］，在多種腫瘤中發(fā)揮腫瘤抑制基因的作用。據(jù)此我們推測(cè)，miR?143可能與MACC1基因存在調(diào)控關(guān)系，它在腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)改變可能是MACC1基因表達(dá)上調(diào)的原因。

本研究中，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR?143在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)明顯下調(diào)，相關(guān)性分析顯示miR?143與MACC1基因的表達(dá)水平呈明顯負(fù)相關(guān)。這與我們前期的預(yù)測(cè)相符。將pre?miR?143和anti?miR?143分別轉(zhuǎn)染U87細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pre?miR?143和anti?miR?143能夠分別下調(diào)和上調(diào)U87細(xì)胞中MACC1蛋白的表達(dá)。進(jìn)一步證實(shí)了miR?143能夠調(diào)控MACC1，抑制其表達(dá)，但MACC1是否為miR?143的靶基因，miR?143是否是通過直接與MACC1基因的3′UTR結(jié)合進(jìn)而抑制其表達(dá)尚不清楚。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)分析明確了miR?143能夠與MACC1基因3′UTR的結(jié)合，對(duì)MACC1基因的表達(dá)起負(fù)性調(diào)控作用。近期已有文獻(xiàn)報(bào)道，miR?143能夠在結(jié)直腸癌細(xì)胞中靶向負(fù)性調(diào)節(jié)MACC1基因的表達(dá)，其抑制效果及與MACC1基因的3′UTR的結(jié)合位點(diǎn)都與本研究結(jié)果相同，這證實(shí)了在多種腫瘤中miR?143對(duì)MACC1基因具有相同的調(diào)控作用［10］。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示miR?143在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào)，且miR?143能夠與MACC1基因的3′UTR結(jié)合，負(fù)性調(diào)控MACC1基因的表達(dá)，miR?143的表達(dá)下調(diào)是MACC1基因在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)上調(diào)的原因之一。

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