（暨南大學血液病研究所，廣州510632）

·技術方法·

含人FABP4基因啟動子熒光素酶報告質粒的構建及鑒定

朱錦燦，陳小宇，祝愛珍，劉成成，劉善淘，劉革修

（暨南大學血液病研究所，廣州510632）

目的構建含有人脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白（FABP4）基因啟動子熒光素酶報告基因質粒pGL3-Basic-FABP4-promoter，為脂類代謝相關藥物研究提供基礎。方法根據(jù)已知人的FABP4基因啟動子序列設計引物，以人DNA為模板，用PCR法擴增出人FABP4基因啟動子的DNA大片段。經(jīng)過限制性內切酶KpnI和XhoI雙酶切后插入到pGL3-Basic載體中；測序鑒定；然后將這些重組質粒瞬時轉染到K293細胞中，并在24 h后檢測其熒光素酶活性。結果構建的含熒光素酶基因的質粒，經(jīng)酶切及測序鑒定結果顯示FABP4啟動子插入的位置和序列正確。轉染細胞后檢測其熒光顯示：重組pGL3質粒轉錄活性較pGL3-Basic質粒明顯增強（P＜0.001）。結論成功構建了pGL3-Basic-FABP4-promoter質粒，為進一步研究FABP4基因的表達調控提供了工具和基礎。

FABP4；啟動子；熒光素酶；質粒；轉染

脂肪酸結合蛋白（fatty acid binding proteins，F(xiàn)ABPs）是細胞質內一類相對低分子質量蛋白［1］。FABPs可以結合多種配體，主要作用是轉運脂類或參與脂類代謝，調整游離配體濃度，直接或間接參與多種細胞調節(jié)過程。脂肪細胞型脂肪酸結合蛋白（adipocyte fatty-acid binding protein，F(xiàn)ABP4），也稱為Ap2、ALBP或A-FABP，主要在脂肪細胞中表達，在甘油三酯形成及脂解過程中參與調控脂生成或溶解的生化過程［2］。近年來FABP4被證明與糖尿病、心血管動脈粥樣硬化癥等疾病密切相關［3］。因此本研究通過構建人FABP4基因啟動子熒光素酶報告基因質粒（pGL3-Basic-FABP4-promoter），建立報告基因轉錄調控體系，以期了解影響脂類代謝相關藥物對其啟動子轉錄活性的調控，為深入研究相關疾病提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

pGL-3basic載體、Wizard?基因組DNA純化試劑盒、質粒提取、純化試劑盒購自Promega公司；T4 DNA Ligase酶、dNTPs、限制性內切酶KpnI、XhoI購于TaKaRa公司；KOD plus neo DNA Polymerase購于ToYoBo公司。E.coli DH5α菌株、K293細胞株由暨南大學血液病研究所保存，DNA凝膠回收試劑盒購自州東盛生物科技有限公司；轉染脂質體Lipo-

fectamine2000購自Invirtogen公司；胎牛血清、RPMI1640、胰酶培養(yǎng)基購自于美國GIBCO公司產(chǎn)品。

1.2 基因組模板的制備

根據(jù)Wizard?基因組DNA純化試劑盒操作方法提取人細胞基因組DNA，接著通過瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA純度及完整性，置于-20°C備用。

1.3 PCR引物的設計

根據(jù)GenBank收錄的FABP4啟動子基因序列，用Primer 5.0軟件自行設計出引物。其序列如下：上游為5′-CGGGGTACCCATTCAGAAAGGAACTTT GTTTCAAATAA-3′，含KpnI酶切位點；下游為5′-CCGCTCGAGATTATTCTTCAAGGTGAGAAGGAAG CTG-3′，含XhoI酶切位點。引物由蘇州金唯智公司合成。

1.4 啟動子片段的克隆

以人細胞基因組DNA為模板。根據(jù)上述引物，利用PCR擴增儀進行擴增；反應條件：94℃變性5 min；98℃30 s，58℃30 s，68℃2 min 40 s，共30個循環(huán)；68℃延伸5 min。獲得一段長5 467 bp的PCR擴增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳獲得分離條帶，參照DNA凝膠回收試劑盒的操作說明回收目的DNA片段。

1.5 pGL3-Basic-FABP4-promoter質粒構建及鑒定

用限制性內切酶KpnI與XhoI雙酶切含F(xiàn)ABP4啟動子PCR回收產(chǎn)物及pGL-3basic載體。酶切產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳后，回收酶切產(chǎn)物。將酶切回收PCR產(chǎn)物及載體于0.2 mL EP管中16°C連接2 h。連接產(chǎn)物轉化DH5α感受態(tài)細胞，于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中選擇培養(yǎng)。篩選陽性克隆，將所選陽性克隆進行擴增。并通過高純度少量提試劑盒提取質粒進行XhoI單酶切鑒定，鑒定正確的克隆送華大基因公司測序驗證。

1.6 細胞轉染及熒光素酶活性的檢測

K293細胞被培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)基中（37℃、5%CO2）。在轉染前將5×105個細胞接種于24孔培養(yǎng)板中。分別以正常K293細胞為對照組；轉染空質粒pGL3-Basic的K293細胞為陰性對照組。轉染pGL3-Basic-FABP4-promoter重組質粒的K293細胞為轉染組。根據(jù)Lipofectamin 2000轉染試劑盒說明書操作方法將pGL3-Basic-FABP4-promoter導入K293細胞。轉染K293細胞24 h后裂解細胞，按照熒光素酶檢測試劑盒的操作說明，在TD20/20熒光照度計上測定熒光值。

1.7 統(tǒng)計學處理

計量資料采用x±s表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計分析軟件，采用兩獨立樣本的t檢驗。以P＜0.05作為統(tǒng)計學顯著性差異標準。

2 結果

2.1 基因組DNA的PCR產(chǎn)物電泳

基因組DNA的PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳結果如圖1。在20 kb以上出現(xiàn)有1條擴增條帶，未出現(xiàn)彌散條帶。

圖1 基因組DNA的PCR產(chǎn)物圖Fig.1 PCR results of genomic DNA

2.2 FABP4啟動子擴增結果

FABP4啟動子PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳結果如圖2所示。在5 kb和6 kb之間出現(xiàn)一條清晰的擴增條帶，與目的基因片段大小一致。

圖2 FABP4啟動子PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.2 PCR results of FABP4promoter

2.3 重組質粒酶切鑒定

經(jīng)質粒提取后進行單酶切XhoI鑒定，酶切產(chǎn)物

于含溴化乙錠（EB）的1%瓊脂糖凝膠上電泳，UVP凝膠成像系統(tǒng)成像結果如圖3所示。圖3中，F(xiàn)ABP4（5 467 bp）在相應的位置切出一條目的條帶（泳道10），說明篩到的2個克隆均為陽性克隆?？蛇x取作該陽性號質粒去測序。

圖3 FABP4啟動子與pGL?3basic載體連接產(chǎn)物的酶切鑒定Fig.3 Identification of pGL3?FABP4 plasmid after digestion.

2.4 測序結果

酶切產(chǎn)物經(jīng)華大基因公司測序。測序結果經(jīng)Blast比對，結果與NCBI上已知序列進行BLAST 99%一致，證實含F(xiàn)ABP4啟動子熒光素酶報告基因質粒構建成功。

2.5 熒光檢測結果

熒光檢測結果如圖4所示。陰性對照組的K293細胞裂解液螢火蟲熒光值低，對照組組的K293細胞裂解液幾乎檢測不到熒光。然而轉染了pGL3-FABP4-promoter重組質粒的轉染組K293細胞裂解液熒光值明顯高于對照組及陰性對照組，差異有統(tǒng)計學意義。說明FABP4啟動子準確插入到了熒光酶基因上游，并對熒光酶基因的表達起到正調控作用。

圖4 不同質粒轉染K293細胞后的相對熒光素酶活性Fig.4 Relative luciferase activity after the K293 cells were transfected with different plasmids

3 討論

FABP4屬于FBBPs家族中的一員，定位于人類8q21染色體區(qū)域，含有4個外顯子和3個內含子，編碼132個氨基酸，相對分子質量為14 588。其蛋白結構由N端的2個α螺旋和10個β折疊組成并以螺旋-卷曲-螺旋的結構域作為帽子覆蓋頂部，形成一個配體結合口袋［4］。

研究發(fā)現(xiàn)，作為脂類的分子伴侶，F(xiàn)ABP4在成熟的脂肪細胞中可占到總蛋白的6%［5］，是脂肪細胞分化晚期表達上調的重要蛋白之一。發(fā)現(xiàn)于脂肪細胞［6］及脂肪組織［7］中，并且在巨噬細胞［8］和單核來源的樹突狀細胞［9］中也有表達。大量動物實驗和臨床資料表明：FABP4水平與多種疾病密切相關，例如FABP4缺陷或給予FABP4抑制劑的小鼠胰島素敏感性提高［10，11］，究其原因為FABP4作為脂肪酸的轉運蛋白，影響著脂肪酸的代謝及脂肪酸信號，從而與糖尿病和動脈粥樣硬化密切相關。另有研究發(fā)現(xiàn)使用FABP4抑制劑干預遺傳和高脂飲食誘導的肥胖小鼠后可改善糖代謝，增加胰島素敏感性，可有效的治療患有嚴重動脈粥樣硬化和糖尿病的小鼠模型［12］。除此以外，F(xiàn)ABP4還跟冠心病、非酒精性脂肪肝等有關［13，14］。

本實驗成功克隆了FABP4啟動子區(qū)的基因序列，并構建了熒火蟲熒光素酶表達質粒pGL3-FABP4-promoter，通過脂質體成功轉染了K293細胞，轉染后24 h進行熒光素酶檢測發(fā)現(xiàn)：轉染了pGL3-basic空白質粒的對照組沒有熒光素酶報告基因的轉錄活性；而轉染了pGL3-FABP4-promoter重組質粒的實驗組能觀察到有顯著的轉錄活性，表明FABP4啟動子的活性驅動了熒光素酶的表達，證明了本研究構建的重組FABP4啟動子片段有良好的啟動活性。

綜上所述，本研究建立了FABP4啟動子熒光素酶報告基因重組質粒，可用于對FABP4啟動子的進一步研究中。為以后構建通過檢測FABP4啟動子活性篩選FABP4抑制劑的方法提供實驗基礎，以達達到治療FABP4相關疾病的目的。

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（編輯 裘孝琦）

Construction ofpGL3-basic-FABP4-promoter Reporter Gene Vector and Detection ofIts Function

ZHUJin-can，CHEN Xiao-yu，ZHUAi-zhen，LIUCheng-cheng，LIUShan-Tao，LIUGe-xiu
（Institute ofHematology，SchoolofMedicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China）

ObjectiveTo constructan FABP4promoterrecombined luciferase reportergene vector，and to detectits function，thus providing a basis for the research on lipid metabolism related medicines.MethodsPrimers were designed based on human FABP4gene promoters，and FABP4 promoters from human genome DNA was replicated by PCR.Then FABP4promoters were inserted into the pGL3-basic vectorafterdouble digestion by restriction enzyme KpnI and XhoI.Positive clones were identified by sequencing.The recombinant pGL3-basic-FABP4-promoter vector were transiently transfected into K293 cells.After 24 hours，the activity of luciferase was detected.ResultsA pGL3 luciferase reporter vector was constructed.The result of sequencing and double digesting of recombined plasmid were completely correct.The results of luciferase detection after transfection showed that the transcriptional activity of recombinant pGL3 plasmid was obviously increased compared with that of pGL3-basic plasmid（P＜0.001）.ConclusionA pGL3 luciferase reporter vector containing human FABP4promoter gene was constructed successfully，which provides a tooland basisforfurtherstudy of FABP4gene expression regulation.

FABP4；promoter；luciferase；plasmid；transfection

Q782

A

0258-4646（2014）02-0166-04

國家自然基金（81270568）

朱錦燦（1987-），男，碩士研究生.

劉革修，E-mail：tliugx@jnu.edu.cn

2013-10-15

網(wǎng)絡出版時間：