賀金娜，曹 棟，*，史蘇佳

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)理學(xué)院，江蘇無錫214122）

蘋果多酚的固相萃取純化研究

賀金娜1，曹 棟1，*，史蘇佳2

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)理學(xué)院，江蘇無錫214122）

研究了用固相萃取法純化，高效液相色譜法測定蘋果中多酚類物質(zhì)的方法。以蘋果凍干粉為原料，加標(biāo)回收率為指標(biāo)，從四種固相萃取小柱中篩選出分離效果較好的Waters Oasis HLB固相萃取小柱對提取液進(jìn)行預(yù)處理。以phenomenex Luna C18色譜柱（150mm×4.6mm，5μm）為固定相，以0.1%的甲酸溶液（v/v）和乙腈為流動(dòng)相梯度洗脫，紫外雙波長掃描280、320nm條件下檢測。結(jié)果：檢測出七種中性多酚，三種酸性多酚。加標(biāo)回收率為95%～104%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.2%。結(jié)論：該方法快速、靈敏、簡便、準(zhǔn)確，雜質(zhì)干擾少，10種多酚類物質(zhì)峰分離度好。

高效液相色譜，固相萃取，蘋果，多酚

蘋果多酚是蘋果中具有苯環(huán)并結(jié)合多個(gè)羥基的化學(xué)物質(zhì)的總稱。研究表明，蘋果多酚具有清除自由基、抗氧化、預(yù)防癌癥、降血壓、預(yù)防心臟病、抗齲齒、抗過敏、抗病毒等80多種生理功能，因此在醫(yī)藥、食品、日用化工等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[1]。

蘋果中的多酚物質(zhì)主要包括黃烷-3-醇類、黃酮醇類、羥基苯甲酸類、二氫查爾酮類、花色苷類等五類[2-4]。蘋果中多酚類物質(zhì)的測定方法主要采用高效液相色譜法，但有機(jī)溶劑萃取得到的粗提物中蘋果多酚的純度較低，影響檢測結(jié)果。傳統(tǒng)的液相色譜法樣品前處理方法，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，純化效果不理想，而且過程中容易造成多酚類物質(zhì)的損失。固相萃取技術(shù)是近年來興起的一項(xiàng)廣泛應(yīng)用的樣品前處理技術(shù)[5-6]，通過選擇不同的固定相與流動(dòng)相進(jìn)行多種搭配組合，實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)組分與雜質(zhì)之間的高選擇性分離。

本研究從Strata C18-E、Waters Oasis HLB、DIKMA ProElut PWA、Strata-X-AW四種固相萃取小柱中篩選出預(yù)處理效果最好的固相萃取小柱對蘋果多酚提取液進(jìn)行純化，高效液相色譜方法分離測定蘋果多酚，取得滿意結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

（+）-兒茶素、對香豆酸、鞣花酸、咖啡酸、異槲皮素、阿魏酸 購于Sigma公司；根皮素、根皮苷、（-）-表兒茶素、綠原酸、沒食子酸、槲皮素、槲皮苷、蘆丁、原花青素B 購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；甲醇、乙腈、甲酸、氨水、醋酸銨 均為色譜純；乙醇、乙酸乙酯、鹽酸、氫氧化鈉 均為分析純；紅富士蘋果

市售。

Waters 1525高效液相色譜儀、Waters 2489紫外檢測器 Waters公司；phenomenex Luna C18色譜柱（150×4.6mm，5μm） Phenomenex公司；日本日立CR21GШ高速低溫冷凍離心機(jī) 日立公司；Forma-86C超低溫冰箱 美國Thermo公司；LGJ-18型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；ND100-1氮?dú)獯蹈蓛x 杭州瑞誠儀器有限公司；JJ-2組織搗碎勻漿機(jī) 常州國華電器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取兒茶素、表兒茶素、蘆丁、異槲皮素、鞣花酸、根皮苷、槲皮素、槲皮苷、根皮素、原花青素B2、沒食子酸、綠原酸、對香豆酸、阿魏酸、咖啡酸各10mg，用甲醇分別溶解并定容至10m L，得到1000μg/m L標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別移取兒茶素2.5m L、表兒茶素2.5m L、蘆丁2.5m L、異槲皮素7.5m L、根皮素0.25m L、根皮苷0.25m L、槲皮素1.25m L、槲皮苷0.75m L、原花青素B20.25m L混合定容至25m L，得到中性多酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取鞣花酸2.5m L、沒食子酸0.625m L、綠原酸0.75m L、對香豆酸0.625m L、阿魏酸0.5m L、咖啡酸0.25m L混合定容至25m L，得到酸性多酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)準(zhǔn)品溶液4℃冰箱中冷藏備用。

1.2.2 樣品的制備 將新鮮的蘋果去核切塊，按100m L NaF（5g/L）對應(yīng)1kg水果的配比將NaF水溶液加入其中[7]，而后加入到組織搗碎勻漿機(jī)中打漿1m in，將蘋果漿置于-72℃下冷凍一夜，之后進(jìn)行冷凍干燥。干燥后的蘋果粉末真空包裝放置在-18℃下保藏待用。

準(zhǔn)確稱取10g蘋果凍干粉兩份分別置于兩個(gè)250m L平底燒瓶中——加標(biāo)瓶和空白瓶，加標(biāo)瓶中加入中性多酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、酸性多酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各5m L，空白瓶中都不加。兩瓶中各加入100m L 70%的乙醇，在60℃超聲下浸提20m in，過濾得到蘋果渣，重復(fù)一次上述浸提步驟。分別合并浸提液后冷卻，將冷卻后的浸提液在9000r/min下離心10min，取上清液備用。

1.2.3 色譜條件 phenomenex Luna C18色譜柱（150× 4.6mm，5μm）；柱溫：30℃；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈，線性梯度洗脫，0～5min：流動(dòng)相A=85%，5～25m in：流動(dòng)相A：85%～50%，25～35m in：流動(dòng)相A：50%～0%，35～40min：流動(dòng)相A=0%，40～41min：流動(dòng)相A：0%～85%，41～45m in：流動(dòng)相A=85%。流速：中性多酚1m L/m in，酸性多酚0.8m L/m in；進(jìn)樣量：10μL；檢測波長：中性多酚280nm，酸性多酚320nm。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限 在已經(jīng)確定的色譜條件下，分別將不同濃度梯度的各種中性多酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液：兒茶素、表兒茶素、原花青素B2、槲皮素、異槲皮素、槲皮苷、根皮素、根皮苷、蘆丁，以及不同濃度梯度的各種酸性多酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液：綠原酸、咖啡酸、沒食子酸、鞣花酸、阿魏酸、對香豆酸進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度和峰面積的關(guān)系進(jìn)行線性回歸，同時(shí)根據(jù)信燥比S/N=3，測得各組分最低檢測濃度。

1.2.5 固相萃取小柱篩選 從加標(biāo)瓶、空白瓶中各取出四份相同體積的蘋果多酚提取液進(jìn)行純化處理，方法見表1。得到八種洗脫液氮吹至干。分別進(jìn)行如下操作：加入蒸餾水20m L溶解，用1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至7.0，轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加入20m L乙酸乙酯，搖動(dòng)10min，分離出酯相和水相，酯相氮吹至干溶于1m L甲醇中，此為中性多酚。水相用6mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH至2.0，再加入20m L乙酸乙酯萃取。分離出酯相和水相，酯相氮吹至干，重新溶解于1m L的甲醇中，此為酸性多酚。在已經(jīng)確定的色譜條件下，對于以上操作得到的16個(gè)多酚樣品進(jìn)行HPLC分析。加標(biāo)樣扣除相對應(yīng)空白樣基準(zhǔn)后得到加入標(biāo)準(zhǔn)的測出量，加入標(biāo)準(zhǔn)的測出量除以標(biāo)準(zhǔn)加入量計(jì)算加標(biāo)回收率，平行測定三次取平均值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限

按1.2.4方法得到標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測限，結(jié)果見表2。

2.2 固相萃取小柱篩選

按1.2.5方法得到四種固相萃取小柱對于各種多酚的加標(biāo)回收率，結(jié)果見表3、表4。

由表3、表4結(jié)果可以看出，對于中性多酚而言，Strata C18-E和Waters Oasis HLB回收率要遠(yuǎn)高于DIKMA ProElut PWA和Strata-X-AW，Strata C18-E和Waters Oasis HLB回收率結(jié)果不相上下。而對于酸性多酚而言，DIKMA ProElut PWA和Strata-X-AW的回收率則高于前面兩種小柱，Strata C18-E和Waters Oasis HLB比較的話，前者對于酸性多酚的回收率要略低一點(diǎn)。綜合考慮中性多酚和酸性多酚兩大類，Waters Oasis HLB固相萃取小柱對于蘋果多酚的處理效果更好，故選擇Waters Oasis HLB固相萃取小柱作為蘋果多酚粗提取液純化處理柱。

2.3 Waters Oasis HLB固相萃取小柱純化效果

酸性多酚和中性多酚的標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖1。

未加標(biāo)原提取液經(jīng)真空濃縮至干，用甲醇重新溶解后的色譜圖見圖2。未加標(biāo)提取液經(jīng)Waters Oasis HLB固相萃取小柱預(yù)處理后的色譜圖見圖3。對比圖2和圖3可知，未經(jīng)處理的蘋果多酚提取液的色譜圖中雜質(zhì)峰很多，無法確定有哪些多酚物質(zhì)。固相萃取小柱處理之后，大部分雜質(zhì)峰不再出現(xiàn)，不會(huì)干擾檢測。對比圖3（A）與圖1（A），可知蘋果中中性多酚有表兒茶素、原花青素B2、蘆丁、異槲皮素、槲皮苷、根皮苷、根皮素。對比圖3（B）與圖1（B），可知蘋果中酸性多酚有咖啡酸、綠原酸、對香豆酸。

表1 四種固相萃取小柱處理樣品方法Table 1 Sample processingmethod of four kinds of solid phase extractionminicolumn

表2 回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢測限Table 2 Regression equation,correlation coefficientand detection limit

圖1 多酚標(biāo)準(zhǔn)溶液HPLC圖譜Fig.1 Chromatogram of polyphenols standards注：A：中性多酚標(biāo)準(zhǔn)溶液；B：酸性多酚標(biāo)準(zhǔn)溶液。

圖2 未經(jīng)固相萃取樣品HPLC圖譜Fig.2 Chromatogram of samplewithout solid phase extraction processing

3 結(jié)論

3.1 本實(shí)驗(yàn)采用固相萃取處理樣品，考察了不同種類固相萃取小柱的預(yù)處理效果。從中篩選出預(yù)處理效果較好的Waters Oasis HLB作為蘋果多酚純化柱。采用高效液相色譜法0.1%甲酸水溶液（v/v）-乙腈梯度洗脫。中性多酚、酸性多酚分別進(jìn)行分析，兩類多酚都得到了很好的分離。本方法簡單快速、結(jié)果可

靠，在一定程度上為蘋果中多酚類物質(zhì)研究提供了依據(jù)。

表3 中性多酚回收率（%）Table 3 Recoverys of neutral polyphenols（%）

表4 酸性多酚回收率（%）Table 4 Recoverys of acidic polyphenols（%）

圖3 經(jīng)固相萃取樣品HPLC圖譜Fig.3 Chromatogram of sampleswith solid phase extraction processing

3.2 紅富士蘋果中主要的多酚物質(zhì)為原花青素B2、表兒茶素、蘆丁、異槲皮素、槲皮苷、根皮苷、根皮素、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸。

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Study on solid phase extraction in the purification of apple polyphenols

HE Jin-na1，CAO Dong1，*，SHISu-jia2
（1.School of Food Science，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2.School of Science，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

A method of solid phase extraction combined with HPLC determination of polyphenols in apple wasstudied. Taking apple lyophilized powder as raw material ，recovery of the polyphenols as the measureindicators，Waters Oasis HLB was screened out from four kinds of solid phase minicolumns to purify the appleextract. Gradient eluation was carried out on the chromatographic column phenomenex Luna C18（150mm×4.6mm，5μm）with the mobile phase consisted of 0.1% formic acid solution（v/v） and acetonitrile. Under theseconditions，the components of apple polyphenols can be perfectly separated. An UV-detector was used forrecording the chromatographic peaks of the apple polyphenols at 280nm and 320nm. The results showed thatpolyphenols in apple were seven kinds of neutral polyphenols and three kinds of acidic polyphenols，therecovery of the polyphenols was in the range of 95%～104% and RSD were lower than 2.2%. This method wasrapid，sensitive，simple，accurate and less impurity interference，and ten kinds of polyphenols peaks wereseparated well.

high performance liquid chromatography；solid phase extraction；apple；polyphenols

TS201.1

：B

：1002-0306（2014）16-0290-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.055

2013-12-03 *通訊聯(lián)系人

賀金娜（1986-），女，碩士研究生，主要從事蘋果多酚方面的研究。