宋興興，張宿義，2，馮 丹，李 瓊，周 軍，2，劉世龍，2，侯長軍，霍丹群，*

（1.重慶大學生物工程學院，重慶400044；2.國家固態(tài)釀造工程技術研究中心，瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000）

龍眼酒的發(fā)酵工藝研究

宋興興1，張宿義1，2，馮 丹1，李 瓊1，周 軍1，2，劉世龍1，2，侯長軍1，霍丹群1，*

（1.重慶大學生物工程學院，重慶400044；2.國家固態(tài)釀造工程技術研究中心，瀘州老窖股份有限公司，四川瀘州646000）

以龍眼果汁為主要原料進行酒精發(fā)酵，在單因素實驗基礎上，選取初始pH、初始糖度、SO2添加量為影響因素，選取酒精度（20℃）和總香味物質含量為響應值，應用中心組合Box-Behnken實驗設計建立數(shù)學模型，進行響應面分析。研究結果表明，在初始糖度28.5%，初始pH3.96，SO2添加量58.8mg/L最優(yōu)條件下，得到最大酒精度（20℃）和總香味物質含量分別為15.17°和2.322g/L，接近于理論預測值為15.28°和2.329g/L，表明用響應面分析法優(yōu)化得到的工藝參數(shù)準確，對工藝設計和生產(chǎn)具有較強的指導價值。

龍眼，發(fā)酵工藝，響應面法

龍眼又稱桂圓、龍目、荔枝奴等，屬于無患子科、龍眼屬[1-2]，果實黃褐色，果肉為白色透明，汁多味甜，富含膳食纖維、VA、VB1、VB2、VC，具有很高的營養(yǎng)價值[3]。龍眼肉質爽脆，風味佳，含糖量在20%左右，是釀酒的上等原料[4-6]。龍眼肉經(jīng)發(fā)酵釀造成龍眼酒，具有養(yǎng)血安神、補精益智、滋陰補腎的功效，對失眠健忘、食欲不振、貧血萎黃、神經(jīng)衰弱、脾虛及婦人產(chǎn)后浮腫血虧諸癥有一定的保健作用[7-8]。龍眼以鮮食為主，由于其保鮮期較短和貯藏技術較落后的限制，部分龍眼進行深加工，如越南龍眼中30%～35%供加工；泰國龍眼保鮮處理和加工的比例很高，一般在70%以上；而我國龍眼加工量不超過總產(chǎn)量的30%。因此對龍眼進行深加工，開發(fā)新產(chǎn)品，提高產(chǎn)品附加值具有重要的意義。由于龍眼的保鮮較難，給鮮果銷售帶來許多困難，把龍眼發(fā)酵成龍眼酒，大大地擴寬了龍眼的銷路，增加了龍眼的附加值。龍眼的傳統(tǒng)加工品是龍眼干，品種單一，附加值低。

為更好利用龍眼這一具有我國南方特色的水果，本文探討了龍眼酒的釀造工藝。以龍眼果汁為原料，在單因素實驗基礎上，運用響應曲面實驗設計探討龍眼酒發(fā)酵的最佳工藝。從而提出更具指導意義的龍眼酒發(fā)酵工藝的最優(yōu)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍眼 福建莆田；菌株 安琪葡萄酒用高活性干酵母，湖北安琪酵母股份有限公司；葡萄糖、碳酸鈣 重慶博藝化學試劑有限公司；亞硫酸、檸檬酸 重慶川東化工（集團）有限公司。

恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海森信實驗儀器有限公司生產(chǎn)；精密電子天平 梅特勒—托利多（上海）有限公司生產(chǎn)；糖度計 天津鏡象儀器公司；酒精度計 河北武強儀表廠；電磁爐 北京市永光明醫(yī)療儀器廠生產(chǎn)；PHS-3C型精密酸度計 上海雷茲公司生產(chǎn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 龍眼鮮果→分選→清洗→剝殼去核→打漿榨汁→調節(jié)pH及糖度→接種→恒溫發(fā)酵→過濾→龍眼發(fā)酵酒→蒸餾→龍眼酒。

1.2.2 操作要點 初始糖度及pH的調整：根據(jù)需要的酒精度，添加的葡萄糖量、檬酸或者碳酸鈣調整果汁的初始糖度pH[10]；酵母活化：在龍眼果汁中按0.05g/m L的量添加干酵母，攪拌溶解，38℃復水活化30m in，冷卻至30℃即可使用[10-11]；恒溫發(fā)酵：將調整好的龍眼果汁控制溫度在25℃下發(fā)酵；蒸餾：取龍眼發(fā)酵原酒蒸餾，得到流出液，即為龍眼酒[12-14]。

1.2.3 單因素實驗 分別以初始糖度、初始pH、SO2添加量[15]等因素對龍眼酒發(fā)酵酒精度的影響進行單因素實驗。

1.2.4 工藝優(yōu)化實驗 在單因素實驗基礎上，根據(jù)響應面中的Box-Behnken的中心組合設計原理[16-18]，選擇初始pH（A）、初始糖度（B）、SO2添加量（C）等為響應面優(yōu)化的考察因素，以酒精度（20℃）和主要香味物質含量為響應值，對龍眼酒發(fā)酵工藝條件參數(shù)進行優(yōu)化。

表1 響應面實驗因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.5 分析方法 糖度：糖度計；pH：pH計；酒精含量：酒精計法；總酸：酸堿滴定法；香味物質含量的測定：氣象色譜-質譜法（GC-MS）。

理化評定主要用酒精度對實驗結果進行評定，主要香味物質作為附加標準進行評判。異丁醇、3-甲基丁醇、甲醇、丁酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸、己酸、辛酸等是果酒中含量較高的微量物質，這對其風味物質特征的形成具有重要的作用，因此主要選擇以上幾種含量較高的微量物質，用總醇、總酯和總酸的代表物質作為香氣成分分析的研究對象。

GC-MS分析條件：a.色譜條件：以N2作為載氣，柱流速為0.5m L/min；分流比為50∶1，尾吹約30～40m L/min；氫氣流速為30m L/min；空氣流速為300m L/min；檢測器溫度220℃；進樣口溫度220℃，程序升溫條件為初始柱溫40℃、保持4m in，以4℃/m in的速度上升至200℃，保持10m in。b.質譜條件：EI電力源，電子能量為70eV，離子源溫度為200℃，接口溫度為250℃，掃描范圍為30～50amu。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 初始糖度對龍眼酒發(fā)酵的影響 固定SO2添加量80mg/L，pH 4.0不變，設置不同的初始糖度，研究其對龍眼酒發(fā)酵的影響，結果見圖1、圖2。酒精度與香味物質含量隨著初始糖度升高而增大。隨著初始糖度的升高，酒精度成增加趨勢（圖1），在初始糖度為33%時最高，但其增長率明顯變小，即增長不明顯；總香味物質含量隨著初始糖度升高呈逐漸增大趨勢（圖2），其中在21%之間達到最大。初始糖度在25%之后，酒精產(chǎn)量和香味物質含量變化不顯著，經(jīng)濟效益不明顯；綜合考慮兩種評價指標的最佳初始糖度，選取初始糖度23%、26%、29%做龍眼酒的響應面分析以確定最佳的初始糖度。

圖1 初始糖度對酒精度影響Fig.1 Influence of initial sugar contenton alcohol content

圖2 初始糖度對主要香味物質的影響Fig.2 Influence of initial sugar contentonmain aroma components content

2.1.2 初始pH對龍眼酒發(fā)酵的影響 固定初始糖度23%，SO2添加量60mg/L不變，設置不同的初始pH，研究其對龍眼酒發(fā)酵的影響，結果見圖3、圖4。酒精度隨著pH的升高而增大（圖3），其中pH為3.0時酒精度最高，而后酒精度降低；主要香味物質含量隨著pH的升高成增大趨勢（圖4）。發(fā)酵pH為3.0～4.5時，酒精產(chǎn)量保持在一個較高的水平，主要香味物質含量在pH為4是達到最大。綜合考慮兩種評價指標的最佳初始pH，由于桂圓的初始pH在7.0左右，降酸時需要加入大量的檸檬酸，考慮到成本因素，選取初始pH3.5、4.0、4.5作龍眼酒的響應面分析以確定最佳的初始pH。

2.1.3 SO2添加量對龍眼酒發(fā)酵的影響 固定初始糖度23%，初始pH3.5不變，設置不同的SO2添加量，研

究其對龍眼酒發(fā)酵的影響，結果見圖5、圖6。隨著SO2添加量的增加，酒精度和香味物質含量逐漸增加，在二氧化硫為60mg/L時達到最大，當二氧化硫添加量大于60mg/L時，酒精度降低（圖5），香味物質含量在SO2添加量為60～80mg/L相對較高（圖6）。當添加SO2為20mg/L和140mg/L時，酒精度都偏小，前者可能是SO2添加量偏低，并且初期迅速被氧化等原因，致使溶液中殘留的SO2更少，失去了抑制雜菌的作用，造成一定的雜菌生長；后者可能是SO2添加量過量，抑制了酵母菌的生長，使發(fā)酵酒精度偏低。綜合考慮兩種評價指標的最佳SO2添加量，選取接種量60、80、100mg/L做龍眼酒的響應面分析以確定最佳的SO2添加量。

圖3 初始pH對酒精度影響Fig.3 Influence of initial pH on alcohol content

圖4 初始pH對主要香味物質的影響Fig.4 Influence of initial pH onmain aromacomponents content

圖5 SO2添加量對酒精度的影響Fig.5 Influence of SO2on alcohol content

圖6 SO2添加量對主要香味物質的影響Fig.6 Influence of inoculation amountonmain aroma components content

2.2 響應面法提取條件的優(yōu)化

2.2.1 響應面實驗設計及結果 對龍眼酒發(fā)酵工藝進行響應面實驗及分析，其具體實驗方案及結果見表2。

表2 龍眼酒發(fā)酵工藝優(yōu)化實驗設計及結果Table 2 Optimization of fermentation conditions design and results of experimental design

利用Design-Expert8.0統(tǒng)計軟件對該實驗數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合，分別獲得酒精度（R1）與總香味物質含量（R2）對自變量初始糖度（A）、初始pH（B）、SO2接種量（C）的多元回歸方程：

模型可靠性可從方差分析結果中考察，從表3和表4分別為以酒精度和總香味物質含量為響應值的回歸分析結果可以看出，兩種模型回歸都顯著（p＜0.0001），失擬項都不顯著，說明兩種模型均與實際實驗擬合較好，自變量與響應值之間線性關系顯著（R2A=0.9987和R2B=0.9839），能很好地對響應值進行預測。

表3 酒精度方差分析結果Table 3 ANOVE of regression analysis on alcohol content

表4 總香味物質含量方差分析結果Table 4 ANOVE of regression analysis onmain aroma components content

由表3可知，方程（1）中除AC項（初始糖度和SO2添加量的交互作用）無顯著影響和AB項（初始糖度和初始pH因素的交互作用）達到顯著水平（p＜0.05）外，其他項對酒精度的影響達到極顯著水平（p＜0.0001）；表4可知，方程（2）中除B項無顯著影響外，其他項對總香味物質含量的影響達到顯著水平（p＜0.05），其中一次項C（SO2添加量），交互項BC（初始pH與SO2添加量因素的交互作用）與二次項B（初始pH）對總香味物質含量的影響達到極顯著（p＜0.01）。另外，通過F值的大小，可以推斷在選定的實驗范圍內(nèi)各因素對實驗結果的重要性，F(xiàn)值越大，其重要性越大，從表3中可知，各因素對酒精度的影響大小順序是：初始糖度＜SO2添加量＜初始pH；從表4中可知，各因素對主要香味物質的影響大小順序是：SO2添加量＜初始pH＜初始糖度。

2.2.2 各因素之間的交互作用 通過Design-Expert 8.0軟件分析，得到的響應面圖7～圖10，從響應面分析圖上可以找到最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的交互作用。圖7～圖10直觀地反映了各因素對響應值的影響，由圖7～圖9可知，初始pH與初始糖度、SO2添加量與初始糖度對酒精度影響均較為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，各因素對酒精度的影響大小順序是：初始糖度＜SO2添加量＜初始pH；從圖10中可知，各因素對主要香味物質的影響大小順序是：SO2添加量＜初始pH＜初始糖度。結合方程與響應面可得到最優(yōu)參數(shù)為：初始糖度28.5%，初始pH 3.96，SO2添加量58.8mg/L。

圖7 初始糖度和初始pH對酒精度影響的曲面圖Fig.7 Response surface of initial sugar and pH on alcohol content

圖8 初始糖度和SO2添加量對酒精度影響的曲面圖Fig.8 Response surface of initial sugar and SO2on alcohol content

圖9 初始pH和SO2添加量對酒精度影響的曲面圖Fig.9 Response surface of initial pH and SO2on alcohol content

圖10 初始糖度和SO2添加量對主要香味物質含量影響的曲面圖Fig.10 Response surface of initial sugar and SO2on total aroma components content

2.2.3 驗證性實驗 在優(yōu)化條件下，酒精含量和總香味物質含量的理論預測值為15.28°和2.329g/L。調整后工藝參數(shù)為初始糖度28.5%，初始pH3.96，SO2添加量58.8mg/L，根據(jù)此最優(yōu)參數(shù)進行3組平行性實驗以驗證響應面法的可行性。結果顯示，平均酒精度和總香味物質含量為15.17°和2.322g/L，與預測值很接近，因此采用響應面分析法優(yōu)化得到的工藝參數(shù)準確，對工藝設計和生產(chǎn)具有較強的指導價值。

3 結論

在單因素基礎上，采用Box-Behnken響應面法（RSM）對龍眼酒發(fā)酵工藝進行優(yōu)化，得出了龍眼酒發(fā)酵工藝的最優(yōu)參數(shù)為：初始糖度28.5%，初始pH 3.96，SO2添加量58.8mg/L。各因素對酒精度的影響大小順序是：初始糖度＜SO2添加量＜初始pH；對主要香味物質的影響大小順序是：SO2添加量＜初始pH＜初始糖度。模型方差分析和響應面分析表明，該模型回歸極顯著，對實驗擬合較好，對優(yōu)化的龍眼酒發(fā)酵參數(shù)具有一定的實際應用價值。

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Study on fermented conditions of Longan wine

SONG Xing-xing1，ZHANG Su-yi1，2，F(xiàn)ENG Dan1，LIQiong1，ZHOU Jun1，2，LIU Shi-long1，2，HOU Chang-jun1，HUO Dan-qun1，*
（1.College of Bioengineering，Chongqing University，Chongqing 400044，China；2.National Engineering Research Center of Solid-State Brewing，Luzhou Laojiao Group Co.，Ltd.，Luzhou 646000，China）

Longan juice was used as the main raw material for fermentation，On the basis of single factor experiment，select the initial pH，initial sugar，SO2dosage as independent variables，using alcoholic content（20℃）and the main aroma components content（g/L）as dependent variables，through Box-Benhnken center composite design established the mathematical regression model and response surface analysis.The result showed that the optimum fermentation of Longan wine：the initial pH3.96，initial sugar content of 28.5%and SO2dosage 58.8mg/L.Under the conditions，the optimum alcoholic content（20℃）and the total aroma components content of Longan base wine were 15.17°and 2.322g/L，which were well matched with the predictive value 15.28°and 2.329g/L.

Longan；fermented conditions；response surface methodology

TS201.1

：A

：1002-0306（2014）16-0170-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.030

2013-11-06 *通訊聯(lián)系人

宋興興（1989-），女，碩士研究生，研究方向：生物學，微生物發(fā)酵。

國家自然基金（81102132，31101284）；四川省科技支撐計劃（2010NZ0093，2013FZ0043）；釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室開放基金（NJ2011-03）；重慶大學大型儀器設備開放基金。