黃勁松，姜 麗，蔣林惠，沙 香，周 翔，楊奕晨，楊 爽，郁志芳，*

（1.池州學(xué)院材料與化學(xué)工程系，安徽池州247000；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095）

不同采收度蕨菜間化學(xué)成分及相關(guān)酶的研究

黃勁松1，2，姜 麗2，蔣林惠2，沙 香2，周 翔2，楊奕晨2，楊 爽2，郁志芳2，*

（1.池州學(xué)院材料與化學(xué)工程系，安徽池州247000；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇南京210095）

以不同生長(zhǎng)期蕨菜為實(shí)驗(yàn)材料，測(cè)定萌芽期、拳卷期及完全展葉期蕨菜中木質(zhì)素、纖維素、可溶性固形物和蛋白質(zhì)的含量及與木質(zhì)素與纖維素合成相關(guān)的酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）、POD（過(guò)氧化物酶）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4-CL）、肉桂醇脫氫酶（CAD）和纖維素酶（CEL）活性。結(jié)果顯示這三個(gè)生長(zhǎng)期的木質(zhì)素含量分別27.78、31.54、49.54mg/g，纖維素的含量為45.53、45.83、81.17mg/g，蛋白質(zhì)含量分別為0.9679、0.6760、0.4980mg/g，可溶性固形物的含量分別為4.0%、3.8%、3.0%，與木質(zhì)素合成的相關(guān)酶PAL、POD、4-CL、CAD酶活逐漸上升。與纖維素合成的相關(guān)酶蕨菜CEL活性也呈上升趨勢(shì)，蛋白質(zhì)含量與可溶性固形物含量呈逐漸下降趨勢(shì)。通過(guò)相關(guān)性與顯著性分析，PAL與POD可能是木質(zhì)素合成的2個(gè)關(guān)鍵酶；隨著生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)，其營(yíng)養(yǎng)成分下降，但木質(zhì)化與纖維化程度加劇，這些會(huì)影響其食用價(jià)值。

蕨菜，不同采收度，木質(zhì)化，纖維化

蕨菜又名蕨苔、龍頭菜、拳頭菜，屬鳳尾蕨科中可食用的多年生草本植物。蕨菜富含對(duì)人體有益的多種營(yíng)養(yǎng)成分，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為蕨菜具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老等作用[1]，近年來(lái)已成為人們喜愛的山野菜[2]。由于新鮮蕨菜在貯藏及運(yùn)銷過(guò)程中易出現(xiàn)組織變硬、變色、風(fēng)味下降等品質(zhì)劣變現(xiàn)象，從而縮短了產(chǎn)品貨架壽命和影響其食用價(jià)值[3-4]。有關(guān)蕨菜的研究集中在干燥保藏[5-6]、化學(xué)保鮮保藏[7-8]、活性成分的提取及應(yīng)用方面[9-10]等研究上，目前未見以不同采收度蕨菜為研究對(duì)象的相關(guān)研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)以蕨菜莖為實(shí)驗(yàn)材料，研究其在不同采收度的蕨菜化學(xué)成分及相關(guān)酶活力的變化，為今后蕨菜的采收期的確定及采后保鮮處理提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蕨菜 取自安徽省池州市貴池區(qū)三臺(tái)山，于2012年3月28日、4月12日、4月27日采收（對(duì)應(yīng)的采收度分別為萌芽期（莖長(zhǎng)度10cm）、拳卷期（20cm）和完全展葉期（30cm））各1500g，經(jīng)清水清洗并洌干后各

分成三份，每份重量約500g，用塑料保鮮袋包裝后置于-80℃冰箱凍藏，用于指標(biāo)的測(cè)定；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、濃硫酸、濃鹽酸、3，5-二硝基水楊酸（DNS）、葡萄糖、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、丙酮、乙酸銨、Tris-平衡酚、甲醇、十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、磷酸二氫鉀、十水合硼酸鈉、硼酸、三水合醋酸鈉、冰醋酸、EDTA、三氯乙酸（TCA）、羧甲基纖維素鈉、羧甲基纖維素、愈創(chuàng)木酚、過(guò)氧化氫（H2O2）、β-巰基乙醇、L-苯丙氨酸、二硫蘇糖醇（DTT）、聚乙烯吡烙烷酮（PVP）、肉桂酸 均為分析純。

SPX-320智能生化培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；DJ300精密電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；85-1恒溫磁力攪拌器、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州國(guó)華電器有限公司；GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；XW-80A微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司；DHG-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；WFJUV-2802 PC紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司。

1.2 指標(biāo)測(cè)定與方法

1.2.1 木質(zhì)素測(cè)定 稱取蕨菜樣品5.0g于研缽中，用液氮研磨至粉狀，加入72%H2SO420m L，并不斷的搖勻，然后在20℃靜置8h，將該混合液移至500m L的平底燒瓶中，加去離子水200m L，100℃回流2.5h，趁熱過(guò)濾，用熱去離子水充分洗滌脫酸后，于60℃烘干至恒重，其含量以mg/gFW表示[11]。

1.2.2 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 參照黃勁松[4]方法，再用Bradford[12]方法定量蛋白質(zhì)，測(cè)定重復(fù)三次，結(jié)果表示為mg/gFW。

1.2.3 過(guò)氧化物酶（POD）活力的測(cè)定 稱取蕨菜樣品2.0g于研缽中，用液氮研磨至粉狀，加入pH 8.7，50mmol/L硼酸緩沖液6.0m L，并轉(zhuǎn)入離心管中，并不斷振蕩，然后以10000×g、4℃離心30m in，上清液即為粗酶液。吸取pH5.4、200mmol/L的NaAC-HAC緩沖液2.0m L，加入20mmol/L愈創(chuàng)木酚溶液1.0m L，加入酶液0.1m L，最后加入0.75%H2O20.1m L，每隔30s記錄吸光值A(chǔ)460的變化，連續(xù)記錄3～5m in。以每分鐘內(nèi)吸光度A460變化0.01所需的酶量為1個(gè)酶活力單位（U），測(cè)定重復(fù)三次，結(jié)果表示為U/gFW[13]。

1.2.4 苯丙氨酸酶解氨酶（PAL）活力的測(cè)定 參照蔡沖方法[14]，定義1h內(nèi)A290增加0.001為PAL的1個(gè)酶活力單位（U），測(cè)定重復(fù)三次，結(jié)果表示為U/gFW。

1.2.5 4-香豆酸輔酶A連接酶（4CL）活力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[15]并稍做修改。稱取蕨菜樣品2.0g于研缽中，用液氮研磨至粉狀，加入pH 8.0、200mmol/L Tris-HCl緩沖溶液（含25%甘油、0.1mmol/L DTT）6.0m L在冰浴上充分研磨勻漿，轉(zhuǎn)入離心管10000×g、4℃離心20m in，上清液即為酶液。3.0m L反應(yīng)液中包括15mmol/L的Mg2+0.5m L，7.5mmol/L的4-香豆酸0.1m L，1.5mmol/L的CoA 0.1m L，75mmol/L的ATP 0.1m L，0.5m L酶液，200mmol·L-1Tris-HCl緩沖液1.7m L，放入40℃恒溫水浴中保溫10m in，冷卻后測(cè)定其A333值，以A333增加0.001為4CL的1個(gè)酶活力單位（U），測(cè)定重復(fù)三次，結(jié)果表示為U/gFW。

1.2.6 肉桂醇脫氫酶（CAD）活力的測(cè)定 參照蔡沖方法[14]，定義1h內(nèi)A340增加0.01為CAD的1個(gè)酶活力單位（U），測(cè)定重復(fù)三次，結(jié)果表示為U/gFW。

1.2.7 纖維素含量的測(cè)定 參考GB 10469-89水果蔬菜粗纖維的測(cè)定方法[16]。

1.2.8 纖維素酶活力的測(cè)定 參照文獻(xiàn)[17]稱取蕨菜樣品2.0g于研缽中，用液氮研磨至粉狀，加入pH4.5、0.04mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液6.0m L于25℃提取1.0h，轉(zhuǎn)入離心管4000×g，4℃離心10m in，上清液即為粗酶液。反應(yīng)體系中加入1%CMC 1.5m L和粗酶液1.0m L，50℃水浴30min，加入3，5-二硝基水楊酸顯色劑3.0m L，沸水中加熱10m in，定容至25.0m L，550nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)550。（以不加酶液作空白對(duì)照）。在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上換算出酶促反應(yīng)生成的葡萄糖的量，以每分鐘催化水解1%CMC溶液轉(zhuǎn)化為1μg葡萄糖所需的酶量為1個(gè)酶活力單位。

1.2.9 可溶性固形物含量測(cè)定 參考GB 12295-90水果蔬菜制品可溶性固形物含量的測(cè)定-折射法[16]。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)

實(shí)驗(yàn)每個(gè)采收度均重復(fù)三次，分別求其平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，并使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS軟件及Excel進(jìn)行顯著性及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同采收度蕨菜的PAL、POD、CAD、4-CL酶活及木質(zhì)素含量的變化

圖1 不同采收度蕨菜PAL酶活的變化Fig.1 The change of PAL enzymatic activity among different picking time

木質(zhì)素為植物次生代謝產(chǎn)物，屬酚類化合物，是構(gòu)成植物細(xì)胞壁次生結(jié)構(gòu)的主要成分，也是植物組織木質(zhì)化的主要原因[18]。木質(zhì)素生物合成途徑的關(guān)鍵酶包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、4-香豆酸輔酶A連接酶（4-CL）、肉桂醇脫氫酶（CAD）、過(guò)氧化物酶（POD），PAL是植物次生代謝的關(guān)鍵酶，PAL能催化苯丙氨酸轉(zhuǎn)化為肉桂酸；CAD是木質(zhì)素合成中的限速酶，催化香豆醛生成相應(yīng)的醇；4CL是位于苯丙烷類共同代謝途徑中類黃酮、木質(zhì)素以及肉桂酸酯等分支代謝途徑交叉點(diǎn)上的關(guān)鍵酶，對(duì)整個(gè)代謝過(guò)程起著重要的調(diào)控作用；而POD則在木質(zhì)素生物合成的最后一步中通過(guò)催化H2O2分解而使木質(zhì)素單體發(fā)生聚合反應(yīng)形成木質(zhì)素[19]。因此，PAL、4CL、CAD和POD酶活升高都能促進(jìn)木質(zhì)素合成，提高蕨菜木質(zhì)化程度，從而促進(jìn)組織衰老，口感變劣。潘騰飛等[20]研究低溫貯藏對(duì)

瑖溪蜜柚汁胞?；c木質(zhì)素代謝的影響，結(jié)果表明木質(zhì)素合成相關(guān)酶活性在整個(gè)貯藏過(guò)程中逐漸升高，且木質(zhì)素含量也隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而增高。本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同采收度蕨菜PAL、POD、4CL、CAD活性及木質(zhì)素含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖1～圖5所示：CAD活性在三種采收度蕨菜中活力低且變化不大，而4CL活性在萌芽期中為54U/gFW，而在拳卷期及完全展葉期分別為150U/gFW及152U/gFW，PAL活性分別為408、522、628U/gFW。而POD的活性分別為4.8、16.9、26.9U/gFW，蕨菜中的木質(zhì)素含量為27.78、31.54、49.54mg/g。本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)顯著性及相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，不同采收度蕨菜的PAL，POD與木質(zhì)素含量呈極顯著正相關(guān)（r分別為0.9278、0.9147），說(shuō)明PAL，POD酶可能是導(dǎo)致蕨菜在生長(zhǎng)過(guò)程中木質(zhì)素合成兩個(gè)關(guān)鍵酶。食品中木質(zhì)素含量上升，其食用的品質(zhì)下降。

圖2 不同采收度蕨菜POD酶活的變化Fig.2 The change of POD enzymatic activity among different picking time

圖3 不同采收度蕨菜4-CL酶活的變化Fig.3 The change of 4-CL enzymatic activity among different picking time

圖4 不同采收度蕨菜CAD酶活的變化Fig.4 The change of CAD enzymatic activity among different picking time

圖5 不同采收度蕨菜木質(zhì)素含量的變化Fig.5 The change of lignin contentamong different picking time

2.2 不同采收度蕨菜的蛋白質(zhì)及可溶性固形物含量的變化

營(yíng)養(yǎng)成分是影響生鮮果蔬品質(zhì)好壞的決定性因素，采收后的果蔬仍然是生命活體，在貯藏過(guò)程中必然發(fā)生內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)成分的分解和變化，從而引起果蔬色、香、味、質(zhì)地及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的變化，超過(guò)一定極限，蔬菜就會(huì)衰老甚至腐爛而喪失營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，尤其在鮮切蔬菜中更迅速更嚴(yán)重。由圖6、圖7可知，在三種采收度蕨菜中蛋白質(zhì)的含量分別為0.9679、0.6760、0.4980mg/g，說(shuō)明在生長(zhǎng)過(guò)程中，蛋白質(zhì)的含量呈下降趨勢(shì)，完全展葉期較萌芽期蛋白質(zhì)含量下降的幅度高達(dá)194.36%。通過(guò)SPSS軟件分析，這三種采收度蕨菜之間的差異達(dá)到極顯著水平。以上結(jié)果與白瑞華等[21]在研究竹筍生長(zhǎng)期營(yíng)養(yǎng)及安全品質(zhì)的分析中，發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)期粗蛋白含量基本呈下降趨勢(shì)是一致的，說(shuō)明在生長(zhǎng)過(guò)程中，蛋白質(zhì)合成能力小于其分解能力，分解的產(chǎn)物可能作為合成其他代謝物的原料。而可

溶性固形物的含量分別為4.0%、3.8%、3.0%，呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低，這與張桂霞研究草莓在成熟過(guò)程中可溶性固形物含量變化有相似之處[22]。

圖6 不同采收度蕨菜的蛋白質(zhì)含量的變化Fig.6 The change of CEL enzymatic activity among different picking time

圖7 不同采收度蕨菜可溶性固形物含量變化Fig.7 The change of soluble solid contentamong different picking time

2.3 不同采收度蕨菜的纖維素含量及CEL酶活的變化

纖維素是構(gòu)成細(xì)胞壁的重要組成成分，蕨菜細(xì)胞壁中纖維素的水平在維持組織特征中起著重要作用，當(dāng)蕨菜組織受到機(jī)械損傷或病蟲害等外界因素侵?jǐn)_時(shí)，蕨菜組織本能的自我保護(hù)功能會(huì)誘導(dǎo)纖維素的大量合成。由圖8、圖9所示，蕨菜在生長(zhǎng)與衰老過(guò)程中，CEL活力上升，蕨菜纖維素的含量均呈上升趨勢(shì)，纖維素含量分別為45.53、45.83、81.17mg/g。在生長(zhǎng)過(guò)程中，完全展葉期較萌芽期纖維素含量增幅高達(dá)178.3%。說(shuō)明纖維化程度顯著提高，同樣會(huì)影響蕨菜的食用價(jià)值。

圖8 不同采收度蕨菜的CEL酶活的變化Fig.8 The change of CEL enzymatic activity among different picking time

圖9 不同采收度蕨菜的纖維素含量的變化Fig.9 The change of cellulose contentamong different picking time

3 結(jié)論

隨著蕨菜采收度的不同，其蛋白質(zhì)及可溶性固形物的含量呈下降趨勢(shì)，表明其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也在降低。另外展葉期蕨菜木質(zhì)素和纖維素含量較萌芽期分別增長(zhǎng)約172.3%和178.3%，說(shuō)明隨著生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)，其木質(zhì)化與纖維化程度加劇。另外測(cè)定與木質(zhì)素與纖維素合成的相關(guān)酶活性也呈上升趨勢(shì)，將促進(jìn)木質(zhì)素與纖維素的合成。通過(guò)相關(guān)性與顯著性分析，PAL與POD可能是蕨菜在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程木質(zhì)化的2個(gè)關(guān)鍵酶。蕨菜隨著生長(zhǎng)期的延長(zhǎng)，其可食用性會(huì)下降，以上因素可能是蕨菜商業(yè)價(jià)值下降的重要原因。

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Research of the chemical components and relevant enzyme fromdifferent harvesting degree of pteridium aquilinum

HUANG Jin-song1，2，JIANG Li2，JIANG Lin-hui2，SHA Xiang2，ZHOU Xiang2，YANG Yi-chen2，YANG Shuang2，YU Zhi-fang2，*
（1.DepartmentofMaterials and Chemical Engineering，Chizhou College，Chizhou 247000，China；2.College of Food Science&Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China）

Lignin content，cellulose content，soluble solid content，protein content and PAL，POD，4-CL，CAD，CELenzyme activity of forming stage，fist curling stage and leaf expansion stage of pteridium aquilinum had beenmeasured respectively. The experimental results showed that the lignin content was 27.78，31.54，49.54mg/g.Cellulose content was 45.53，45.83，81.17mg/g. Protein content was 0.9679，0.6760，0.4980mg/g. Soluble solidscontent was 4.0%，3.8% and 3.0% respectively. Enzymes activity related to lignin biosynthesis such as PAL，POD，4-CL，CAD increased. Protein content and soluble solid content of pteridium aquilinum also decreased.By means of relevance and significance analysis，PAL and POD might be two kinds of key enzymes of ligninsynthesis. The above results indicated that nutritional value descended and the degree of lignification andfibrosis increased during its development. Edible value was also affected.

pteridium aquilinum；different harvesting degree；lignification；fibrosis

TS255.3

：A

：1002-0306（2014）16-0129-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.020

2013－11－25 *通訊聯(lián)系人

黃勁松（1979-），男，碩士研究生，講師，主要從事采后生物學(xué)與處理技術(shù)方面的研究。

安徽省教育廳科研資助項(xiàng)目（KJ2013Z237）；院級(jí)自然項(xiàng)目（2014ZRZ002）。