簡華君，張海瑞，黃小林，陳 潔

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122）

堿溶熱處理對大豆分離蛋白溶解度、熱聚集和流變性質(zhì)的影響

簡華君，張海瑞，黃小林，陳 潔*

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫214122）

以大豆低溫脫脂豆粕為原料提取大豆分離蛋白（SPI），在傳統(tǒng)堿溶酸沉法制備SPI的堿溶階段采用不同程度的熱處理（25、50、60、70、80℃），研究了堿溶熱處理對SPI溶解度、熱聚集和流變性質(zhì)的影響。其結(jié)果表明，堿溶熱處理破壞了SPI的溶解度，可溶性部分含有大量由二硫鍵結(jié)合的大分子聚集體。堿溶熱處理能提高蛋白彈性模量的同時降低凝膠點溫度。適當(dāng)?shù)膲A溶熱處理（60℃）不僅能保留較好的蛋白溶解度，還能獲得最佳的凝膠彈性。

大豆分離蛋白，堿溶熱處理，溶解度，熱聚集，流變性質(zhì)

大豆分離蛋白（SPI）作為一種高蛋白低脂的功能性成分被廣泛應(yīng)用在肉制品中，從而達(dá)到健康和改善產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)的目的。但傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的SPI產(chǎn)品往往表現(xiàn)出凝膠性不強的特點，該問題將直接影響到SPI在肉制品和其他相關(guān)產(chǎn)品中的應(yīng)用效果。因此，如何提高SPI凝膠性，及其和肌肉蛋白相互作用關(guān)系，一直是肉制品行業(yè)的研究課題。

熱處理作為一種簡單易操作的方法，常被用于對SPI功能性質(zhì)的改性研究中?，F(xiàn)有研究主要是針對商業(yè)SPI或?qū)嶒炇姨崛〉腟PI終成品進(jìn)行加熱等方法的改造，很少有關(guān)于在SPI提取工藝階段中進(jìn)行附加熱處理對蛋白溶解性、熱聚集和凝膠性的報道。有研究證明天然SPI的凝膠性質(zhì)很差[1-2]，原料來源不同的商業(yè)SPI也可能有較弱的凝膠性[3]。預(yù)熱處理能提高SPI的凝膠能力，但對SPI所含兩大主要組分7S和11S的凝膠質(zhì)量影響不同[4-5]。Shiga and Nakamura發(fā)現(xiàn)將SPI在70℃加熱8min后的凝膠能力比未經(jīng)熱處理的樣品顯著提高[6]。經(jīng)過預(yù)熱處理的SPI不僅會改善自身的凝膠性質(zhì)，還會進(jìn)一步影響到SPI在肉制品中的應(yīng)用效果。Feng and Xiong發(fā)現(xiàn)經(jīng)過預(yù)熱處理的SPI能明顯提高肉蛋白凝膠性質(zhì)和法蘭克福香腸的品質(zhì)，但未經(jīng)變性的天然SPI卻起破壞作用[7-8]。

本論文以低溫脫脂豆粕為原料，以傳統(tǒng)的堿溶-酸沉-中和法為基準(zhǔn)，在生產(chǎn)工藝中的堿溶階段引入不同程度熱處理（25、50、60、70、80℃），對SPI進(jìn)行改性，最后進(jìn)行噴霧干燥獲得SPI成品。研究了堿溶階段的熱處理對SPI溶解性、熱聚集和流變性質(zhì)的影響，以便于為提高SPI凝膠性的生產(chǎn)工藝研究提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

低溫脫脂豆粕 益海嘉里秦皇島金海工業(yè)公司提供；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）、β-巰基乙醇等 購自Sigma公司；鹽酸和

氫氧化鈉等 為分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Avanti J-26 XP高速冷凍離心機 美國Beckman公司；SevenEasy pH計 瑞士梅特勒-托利多公司；DC10-K10加熱制冷循環(huán)器 德國HAAKE Thermo公司；AR 1000流變儀 美國TA公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆分離蛋白SPI的提取和堿溶階段熱處理

根據(jù)Ram irez的方法提取大豆分離蛋白[9]。低溫脫脂豆粕用10倍水浸泡，分別在25、50、60、70、80℃循環(huán)水浴中調(diào)節(jié)pH 8.0，并攪拌堿溶熱處理1h。然后在pH 4.5條件下酸沉，得到的凝乳在pH 7.0復(fù)溶，所有蛋白液均噴霧干燥得到自制SPI，堿溶25℃條件下制備的SPI視為空白SPI樣品。

1.2.2 大豆蛋白溶解度的測定 用去離子水配制大豆蛋白液（蛋白濃度2%，w/w，pH 7.0），并攪拌溶解1h，然后離心（10，000×g，15m in）。參照GB/T 5009.5-2010的凱氏定氮法分別測定原液和上清液中的蛋白質(zhì)含量，單位為g/100m L。計算公式為：蛋白溶解度（%）=上清液中蛋白含量/原液中蛋白含量×100。

1.2.3 分子量分布的測定 采用HPLC測定大豆蛋白樣品的分子量分布，使用島津高效液相色譜連接Shodex Protein KW-804凝膠柱和紫外檢測器（280nm）。蛋白樣品（2%，w/w）離心（10，000×g，15m in）后的上清液稀釋到1mg/m L。流動相為含有0.3mol/L NaCl的50mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.0；洗脫速率1m L/m in；洗脫時間30min。

1.2.4 SDS-聚丙烯酰胺電泳（SDS-PAGE） SDSPAGE的操作方法參考[10]，大豆蛋白樣品配制成5mg/m L（w/w）溶液，10，000×g離心15m in取上清液并稀釋至2mg/m L。離心后的上清液與等體積的電泳樣品緩沖液（含20%甘油、4%SDS、0.125mol/L Tris，pH 6.8）混合，使得上樣前的蛋白濃度均為1mg/m L。濃縮膠和分離膠中丙烯酰胺的濃度分別為5%和12%。非還原條件中添加1mmol/L的N-ethylmaleim ide（NEM，一種巰基阻斷劑），以防止大豆蛋白在樣品處理過程中形成新的二硫鍵。在還原條件下則添加5%的β-巰基乙醇用于檢測二硫鍵的作用。電泳過程中，濃縮膠部分使用10mA電流，待樣品進(jìn)入分離膠后改至20mA。電泳結(jié)束后，膠板用考馬斯亮藍(lán)G-250染色2h，再脫色直至底色褪去，使用BIO-RAD公司的Gel Doc EZ Imager掃描儀對膠板進(jìn)行掃描。

1.2.5 流變性質(zhì)的測定 大豆蛋白流變性質(zhì)的測定方法參考文獻(xiàn)[11]。使用流變儀監(jiān)測大豆蛋白在升溫-保溫-降溫過程中彈性模量G′的變化情況，并在樣品邊緣滴加硅油防止樣品水分蒸發(fā)。主要實驗參數(shù)為：蛋白濃度12%（w/w），平板夾具直徑4cm，間隙1mm，頻率0.1Hz，最大應(yīng)變0.01。樣品先以5℃/m in的速率從20℃升溫至90℃，再在90℃保溫30m in，最后以5℃/m in的速率從90℃降溫至20℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 堿溶溫度對SPI溶解度和分子量分布的影響

圖1和圖2分別表示在大豆蛋白提取的堿溶階段時不同程度的熱處理對SPI溶解度和分子量分布的影響。圖1的結(jié)果表明隨著堿溶階段熱處理溫度的升高，SPI的溶解度呈現(xiàn)出逐漸降低的趨勢，且當(dāng)溫度高于60℃后對溶解度的損害效應(yīng)很顯著（p＜0.05）。與空白SPI相比，70℃和80℃熱處理SPI的溶解度分別明顯下降了9.5%和24.7%。有報道稱低于100℃的熱處理會引起蛋白過度聚集從而導(dǎo)致溶解度的降低[7，12-13]。Guo Jian and Yang Xiao-Quan等利用小角X光散射和動態(tài)光散射技術(shù)，發(fā)現(xiàn)7S的可溶性熱誘導(dǎo)聚集體呈現(xiàn)出大小有限和欠緊密的構(gòu)象，但11S的不溶性熱聚集體卻是核緊殼疏的粒子結(jié)構(gòu)[14]。圖2的分子量分布結(jié)果則進(jìn)一步說明了堿溶時熱處理對SPI聚集情況的影響。從圖2中可見，堿溶25℃條件下制備的空白SPI主要有四個洗脫峰。根據(jù)所用凝膠柱的分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線，可知峰1代表可溶性蛋白分子聚集體（分子量＞669ku），峰2和峰3分別代表大豆蛋白兩大主要組分11S和7S（分子量分別約為340ku和212ku），7S和11S解離的亞基片段則主要集中在峰4中，分子量范圍為54～10ku。與空白SPI相比，50℃熱處理可視為基本沒有改變SPI的分子量分布形式。隨著堿溶溫度的升高，峰1對應(yīng)的可溶性聚集體含量明顯增大，其他三個峰面積比例均有所下降。60℃熱處理時，峰2、峰3和峰4的峰面積相對減小程度類似，說明峰1對應(yīng)的大分子聚集體主要是由7S、11S和解離亞基聚集形成的，且該部分的蛋白亞基組成和空白蛋白組成的比例基本類似。Mession JL等研究豌豆球蛋白的熱聚集情況

時也發(fā)現(xiàn)了類似結(jié)果[15]。當(dāng)堿溶溫度升高到70℃時，可溶性聚集體的相對含量達(dá)到最大，由空白SPI的7%提高到66%，7S和亞基所在的峰基本消失，11S峰面積也進(jìn)一步減小。而當(dāng)堿溶溫度進(jìn)一步升高至80℃時，可溶性聚集體含量反而明顯減少，這可能是因為高溫引起蛋白可溶性聚集體進(jìn)一步過度聚集形成了不可溶性聚集體，這與圖1顯示80℃熱處理導(dǎo)致蛋白溶解度比空白樣品顯著下降了約25%結(jié)果相一致。

圖1 堿溶溫度對SPI溶解度的影響Fig.1 Effectof alkaline-heating treatment on the solubility of SPI

圖2 堿溶溫度對SPI分子量分布的影響Fig.2 Effectof alkaline-heating treatmenton themolecular weight distribution of SPI

2.2 SDS-PAGE分析

利用SDS-PAGE凝膠電泳方法，進(jìn)一步分析了堿溶階段的熱處理對大豆蛋白聚集情況的影響（見圖3）。從不加β-巰基乙醇的非還原電泳圖可看出，隨著堿溶溫度的增加，樣品在濃縮膠和分離膠頂端的條帶逐漸加深，說明形成了較多的大分子可溶性聚集體。同時也可以看出，隨著堿溶溫度的升高，7S-β亞基、11S-AB亞基和11S-B亞基條帶均顯示逐漸變淺的趨勢，這說明堿溶熱處理主要使7S和11S亞基受熱解離和聚集，形成了大分子聚集體，這與圖2分子量分布的結(jié)果相吻合。在添加β-巰基乙醇后的還原電泳圖可以看到濃縮膠上的聚集體基本被還原成了亞基，而分離膠頂端的條帶顏色仍比空白樣品深。這說明堿溶階段熱處理誘導(dǎo)形成的蛋白聚集體主要通過二硫鍵和其他共價作用形成的。Petruccelli S和A?ón，M.研究了大豆蛋白的熱聚集情況，認(rèn)為7S-β亞基、11S-AB亞基和11S-B的聚集源于巰基/二硫鍵的相互轉(zhuǎn)換作用，他們還認(rèn)為7S-β和11S-B之間的相互作用是先后分別由疏水作用和二硫鍵穩(wěn)定的[16]。結(jié)合蛋白凝膠過程中彈性模量的結(jié)果（見圖4），說明大豆分離蛋白提取的堿溶階段熱處理形成的大分子聚集體可顯著地影響大豆蛋白的流變性質(zhì)。適當(dāng)?shù)膲A溶熱處理（如60℃）不僅可以保留較好的溶解度，而且誘導(dǎo)形成的聚集體還能顯著改善大豆蛋白的流變性。Nagano T等也報道了預(yù)熱處理非常顯著地提高了大豆分離蛋白的彈性模量[1]。

圖3 不同堿溶溫度處理SPI的SDS-PAGE圖Fig.3 The SDS-PAGE pattern of the alkaline-heating treated SPI

2.3 堿溶溫度對SPI流變性質(zhì)的影響

圖4為堿溶熱處理的大豆蛋白流變性（主要依據(jù)監(jiān)測彈性模量G′）隨溫度掃描的動態(tài)變化情況。圖4中結(jié)果顯示，所用經(jīng)過堿溶階段熱處理的蛋白樣品的彈性模量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未經(jīng)熱處理的空白樣品。所有樣品的G′值在升溫階段都有個初始下降的過程，這主要是因為樣品在提取和噴霧干燥過程中受熱而形成了一部分聚集體，當(dāng)溫度逐漸升高時，這部分預(yù)先形成的聚集體發(fā)生解離后引起G′值的降低。當(dāng)溫度升至75～90℃區(qū)間時，所有樣品的G′值均很顯著地迅速增大，且隨堿溶溫度越高，G′突變溫度點越低。Gosal WS and Ross-Murphy SB曾報道球蛋白在遇熱開始凝膠時，G′的對數(shù)值有一個接近于90°的突躍點，此時表明蛋白開始由液體向固態(tài)凝膠轉(zhuǎn)變[17]。李云等也發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果[18]，這主要是因為大豆蛋白中的7S在75℃時開始變性，分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)展開，各疏水基團(tuán)相互作用增強開始交聯(lián)形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。在90℃的保溫階段，所有樣品的G′值繼續(xù)增大，主要因為此時大豆蛋白中的11S開始變性，原有的二硫鍵和巰基受熱氧化新形成的二硫鍵進(jìn)一步增強了蛋白分子之間的共價作用，加固了蛋白的凝膠網(wǎng)絡(luò)，彈性模量增強。最后在降溫階段，G′又有很明顯的提高，此時主要由氫鍵起作用。同時，根據(jù)Renkema等對蛋白凝膠溫度的定義[11]，可知隨堿溶溫度的升高，各樣品的凝膠溫度逐漸降低，分別為89、84、81、74、70℃。由此可見，堿溶階段熱處理既可以降低蛋白凝膠溫度，促進(jìn)凝膠網(wǎng)絡(luò)形成，又能大大提高蛋白凝膠的彈性。

圖4 堿溶溫度對SPI凝膠彈性模量的影響Fig.4 Effectof alkaline-heating treatmenton the elasticmodulus of SPI

3 結(jié)論

在傳統(tǒng)堿溶酸沉法生產(chǎn)大豆分離蛋白的堿溶階段引入熱處理，對大豆蛋白的溶解度具有破壞作用，其可溶部分含有大量主要由二硫鍵結(jié)合的大分子聚集體。堿溶熱處理能提高大豆蛋白凝膠彈性模量的同時降低凝膠溫度。適當(dāng)?shù)膲A溶熱處理（如60℃）既能保留較好的溶解度，又能顯著提高蛋白的流變性質(zhì)。而堿溶溫度太高（如70℃和80℃）雖也能一定程度上增強蛋白的彈性模量，但溶解度受到了嚴(yán)重破壞（70℃和80℃熱處理使大豆蛋白的溶解度分別下降了9.5%和24.7%）。本研究結(jié)果對提高大豆蛋白凝膠性的工藝條件調(diào)整具有一定的參考價值。

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Effects of alkaline-heating treatment on the solubility，thermal aggregation and rheological property of soybean protein isolate

JIAN Hua-jun，ZHANG Hai-rui，HUANG Xiao-lin，CHEN Jie*
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

Soybean protein isolate（SPI） was prepared from low-heat defatted soy flour，and preheated duringalkaline extraction. The effects of alkaline-heating treatment（25，50，60，70 and 80℃） on the solubility，thermalaggregation and rheological property of SPI were studied. The results showed that alkaline-heating treatmentdestroyed the protein solubility. The soluble portion of SPI samples contained a large number of aggregateswhich were mainly cross-linked by disulfide bonds. The alkaline-heating treatment could significantly improvethe elastic modulus but decrease the gel point temperature of SPI samples. Alkaline -heating at 60℃ wasproved to maintain a relatively fine solubility and exhibit the best elasticity of SPI.

soybean protein isolate；alkaline-heating；solubility；thermal aggregation；rheological property

TS201.2

：A

：1002-0306（2014）16-0101-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.013

2013－11－11 *通訊聯(lián)系人

簡華君（1985-），女，博士，研究方向：食品加工與組分變化。

國家863計劃（2013AA102204）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金項目（JUSRP21108）；江南大學(xué)博士研究生科學(xué)研究基金項目。