趙 靜，劉 鵬，錢 鐳

（1.黑龍江東方學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)部，黑龍江哈爾濱150086；2.國(guó)家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱150086）

UPLC-MS/MS檢測(cè)原料奶中脫呋喃甲酰基頭孢噻呋殘留方法的建立

趙 靜1，2，劉 鵬2，*，錢 鐳1，*

（1.黑龍江東方學(xué)院食品與環(huán)境工程學(xué)部，黑龍江哈爾濱150086；2.國(guó)家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，黑龍江哈爾濱150086）

目的：建立超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）測(cè)定原料奶中脫呋喃甲?；^孢噻呋來(lái)間接衡量頭孢噻呋殘留的方法。方法：利用T3色譜柱，以含有0.02%的甲酸水-乙腈溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用二硫赤蘚糖醇將原料奶中頭孢噻呋分解為脫呋喃甲酰頭孢噻呋（DFC），由碘乙酰胺衍生化為穩(wěn)定的DFC乙酰胺形式（DCA），樣品再經(jīng)HLB固相萃取柱富集凈化后，進(jìn)行UPLC-MS/MS檢測(cè)。結(jié)果：m/z 430.12＞125.79為定量離子對(duì)，m/z 430.12＞241.04為定性離子對(duì)，回收率在98.6%～102.2%，精密度（RSD）為2.51%～3.87%，最低檢出限為0.45ng/mL。結(jié)論：該方法可用于原料奶中脫呋喃甲?；^孢噻呋殘留的測(cè)定。

超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，脫呋喃甲酰基頭孢噻呋，原料奶

頭孢噻呋（ceftiofur），又名塞得福[1]，屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素[2]，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、陰性菌甚至一些厭氧菌都具有很強(qiáng)的抗菌活性[3]，因其抗菌譜廣，抗菌活性強(qiáng)等特點(diǎn)，被美國(guó)和日本等國(guó)正式批準(zhǔn)用于禽畜等的細(xì)菌性疾病的治療[4]，但其不規(guī)范的使用則會(huì)導(dǎo)致藥物在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的殘留，并由此而通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，危害人體的健康。因此，為了保障人們的身體健康，許多國(guó)家都制定了嚴(yán)格的限量要求，歐盟2002年4月頒布了關(guān)于頭孢噻呋在牛奶中的最大殘留量（MRLS），是100μg/kg[5]；我國(guó)農(nóng)業(yè)部獸藥使用規(guī)定，奶中的殘留限量也是100μg/kg（農(nóng)業(yè)部公告2002年第235號(hào)附錄2）[6]。

牛奶中頭孢噻呋殘留量的檢測(cè)方法主要有微生物法[7-8]、酶聯(lián)免疫[9]、薄層色譜法[10-11]、高效液相色譜法[12-14]，但是大部分檢測(cè)方法都是直接檢測(cè)頭孢噻呋，而本研究是通過(guò)測(cè)定主要分解產(chǎn)物間接反映出頭孢噻呋的量。20世紀(jì)90年后，隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和檢測(cè)要求的不斷提高，液質(zhì)聯(lián)用法因其良好的適用性和高靈敏度已成為檢測(cè)各種抗生素類藥物的主要檢測(cè)方法[15-22]。

頭孢噻呋在動(dòng)物體內(nèi)很快代謝為脫呋喃甲酰基頭孢噻呋（DFC），DFC較不穩(wěn)定，因此本實(shí)驗(yàn)利用二硫赤蘚糖醇將原料奶中頭孢噻呋分解為脫呋喃甲?；^孢噻呋（DFC），由碘乙酰胺衍生化為穩(wěn)定的DFC

乙酰胺形式（DCA），樣品再經(jīng)HLB固相萃取柱富集凈化后，采用超高壓液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLCMS/MS）法進(jìn)行測(cè)定。該方法靈敏度高，凈化效果好，重現(xiàn)性好，定量檢出限為1.25ng/m L，低于頭孢噻呋殘留限量100ng/m L，可以滿足對(duì)原料奶中頭孢噻呋及其衍生物殘留的檢測(cè)要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫呋喃甲?；^孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）、二硫赤蘚糖醇（純度95%）、碘乙酰胺（純度95%） TRC公司；乙腈、甲酸 色譜純；硼酸、氯化鉀、磷酸二氫鉀等 均為分析純；所用水 均為超純凈水。

2695高效液相色譜儀（包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、Empower色譜工作站，配2998二極管陣列檢測(cè)器）、ACQUITY超高壓液相色譜儀、Waters Xevo TQ質(zhì)譜儀 美國(guó)Waters公司；QGC-12T型干熱式氮吹儀 上海泉島科貿(mào)有限公司；BS210S型電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；超純水儀 美國(guó)密理博公司；固相萃取裝置 美國(guó)Mediwax公司。

1.2 溶液的配制

脫呋喃甲?；^孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)貯備液（100μg/m L）：準(zhǔn)確稱取25mg去呋喃甲?；^孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈-水=90∶10定容于25m L容量瓶中，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

硼酸鹽緩沖液（pH=9）：準(zhǔn)確稱取四硼酸鈉1.9000g，氯化鉀0.3700g，加水約70m L后用鹽酸調(diào)節(jié)pH至9.0，定容至100m L容量瓶中。

磷酸鹽緩沖液（pH=7）：準(zhǔn)確稱取0.3400g磷酸二氫鉀，加水約70m L后用20%氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH至7.0，定容于100m L容量瓶中。

提取液：稱取1.0g二硫赤鮮醇，用硼酸鹽緩沖液溶解并稀釋至250m L容量瓶中，現(xiàn)配現(xiàn)用。

碘乙酰胺溶液：稱取5.0g碘乙酰胺，用磷酸鹽緩沖液溶解并定容于50m L容量瓶中，現(xiàn)配現(xiàn)用。

25%磷酸溶液：取25m L磷酸，加水溶解并稀釋至100m L。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC?HSST3 2.1mm×100mm，粒徑1.8μm

流動(dòng)相：A為0.02%甲酸/水，B為乙腈；流速：0.3m L/m in；梯度洗脫條件詳見(jiàn)表1；柱溫：30℃；樣品溫度：15℃；進(jìn)樣體積：10μL。

表1 UPLC-MS/MS梯度洗脫條件Table 1 The linear gradient condition of UPLC-MS/MS

1.3.2 質(zhì)譜條件 電離方式：ESI（+）；毛細(xì)管電壓（Capillary voltages）：3.0kV；錐孔電壓：34V；源溫度：150℃；去溶劑氣溫度（Desolvation Temperatures）：450℃；去溶劑氣流速（Desolvation gas flow）：800L/hr；反吹氣（Cone gas flow）：50L/hr；碰撞氣流速（Collision gas flow）：0.3m L/m in；掃描模式：正離子掃描，多反映監(jiān)測(cè)；脫呋喃甲?；^孢噻呋母離子為m/z 430.12，子離子為m/z 125.79*和m/z 241.04。其中*為定量分析離子。

1.3.3 牛奶樣品前處理 取5.0m L牛奶置于50m L離心管中，加入35m L提取液，混勻，于50℃恒溫箱中保溫15m in。加入10m L碘乙酰胺溶液，搖勻，室溫下靜置衍生30min。用25%的磷酸溶液調(diào)節(jié)pH至2.5～2.6，離心25m in（4℃，6000r/m in）。

依次用3m L甲醇、3m L水活化HLB萃取柱，取5m L上清液過(guò)柱，流速為1m L/m in，用3m L水淋洗小柱之后，用5m L 90%乙腈溶液洗脫，洗脫液用60℃氮吹吹干，殘余物用1m L乙腈/水=90∶10溶液復(fù)溶，過(guò)0.22μm濾膜，供測(cè)定。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 將脫呋喃甲?；^孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，依次稀釋為2、5、25、50、75、100、200ng/m L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，衍生化處理后上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣3次，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度水平為橫坐標(biāo)，以待測(cè)物色譜圖的平均峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 方法的專屬性 分別取3個(gè)空白奶樣，按樣品處理方法項(xiàng)下操作，獲得空白樣品的色譜圖，將濃度為10μg/m L的標(biāo)準(zhǔn)工作液加入空白基質(zhì)中，依同法操作，獲得相應(yīng)的色譜圖，將濃度1μg/m L的標(biāo)準(zhǔn)工作液依同法操作，獲得相應(yīng)的色譜圖。

1.3.6 精密度和準(zhǔn)確度的測(cè)定 分別在同一天和連續(xù)5d制備濃度為25、100、200ng/m L的頭孢噻呋原料奶樣品，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)重復(fù)，根據(jù)日內(nèi)與日間標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度和精密度。

1.3.7 回收率 配制標(biāo)準(zhǔn)濃度分別為25、100、200ng/m L的脫呋喃甲酰基頭孢噻呋原料奶樣品，每一濃度進(jìn)行5個(gè)樣本分析，獲得相應(yīng)的峰面積，以每一濃度處理的樣品與理論添加標(biāo)準(zhǔn)品量的比值計(jì)算方法回收率。

1.3.8 靈敏度 向空白奶樣中添加不同濃度的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以信噪比S/N=3時(shí)的最低濃度為最低定性檢測(cè)限，S/N=10時(shí)的最低濃度為最低定量檢測(cè)限。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇 根據(jù)脫呋喃甲?；^孢噻呋的性質(zhì)，選擇了反相色譜柱，同時(shí)比較了常用的兩種色譜柱：C18色譜柱和T3色譜柱，發(fā)現(xiàn)C18色譜柱雜質(zhì)干擾峰較多，并且有嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象，而T3色譜柱可以很好的改善以上問(wèn)題，使脫呋喃甲?；^孢噻呋與其他雜質(zhì)可以得到很好的分離，并且無(wú)拖尾現(xiàn)象，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇T3色譜柱作為分析柱。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇 在UPLC-MS/MS分析中，反相髙效液相色譜常用的溶劑，如水、甲醇和乙腈十分有

利于電噴霧離子化。本實(shí)驗(yàn)比較了甲醇—水和乙腈—水為流動(dòng)相時(shí)目標(biāo)物的分離及響應(yīng)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：乙腈—水作為流動(dòng)相其分離效果更好，且其響應(yīng)值較高。另外，由于脫呋喃甲?；^孢噻呋在水溶液中容易形成游離態(tài)的離子，不利于反相色譜柱的保留和分離，所以在流動(dòng)相中添加甲酸來(lái)改善色譜柱的保留和分離行為。本實(shí)驗(yàn)比較了水相中甲酸濃度為0.01%、0.02%、0.05%、0.1%、0.2%（v/v）對(duì)目標(biāo)物離子化效率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)水相中含0.02%甲酸時(shí)，目標(biāo)物的離子化效率最高，最終選擇乙腈-水（含0.02%甲酸）溶液作為流動(dòng)相。

2.1.3 流速的選擇 根據(jù)UPLC-MS/MS分離原理，流動(dòng)相流速過(guò)大和過(guò)小都會(huì)影響目標(biāo)物與雜質(zhì)的完全分離，同時(shí)會(huì)影響離子化效率和靈敏度，考慮分離效果、分離時(shí)間和靈敏度等綜合因素，結(jié)合Esr源的推薦流速[23]，設(shè)置流動(dòng)相的流速為200μL/min。

2.1.4 柱溫的選擇 在合適的色譜柱和優(yōu)化的流動(dòng)相條件下，脫呋喃甲?；^孢噻呋便可與雜質(zhì)達(dá)到完全分離，因此本實(shí)驗(yàn)選擇的柱溫為30℃。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

用濃度為100ng/m L的單一標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用流動(dòng)注射進(jìn)樣，在電噴霧正離子模式下進(jìn)行質(zhì)譜全掃描分析，在MSTune界面觀察并調(diào)諧各離子源參數(shù)，優(yōu)化電噴霧電壓、載氣流速、毛細(xì)管溫度等參數(shù)，以豐度較大的離子峰m/z 430.12作為母離子，得到脫呋喃甲?；^孢噻呋的母離子掃描圖（圖1）；對(duì)母離子進(jìn)一步進(jìn)行子離子掃描，優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)，獲得碎片離子峰，選擇其中響應(yīng)較強(qiáng)的兩個(gè)子離子m/z 241.04和m/z 125.79作為監(jiān)測(cè)該物質(zhì)的碎片離子，并以峰形好、響應(yīng)值低的一個(gè)離子m/z 125.79作為定量離子（圖2）。優(yōu)化的質(zhì)譜條件下，得到脫呋喃甲?；^孢噻呋的總離子流色譜圖（圖3）。

圖1 脫呋喃甲?；^孢噻呋的母離子掃描圖Fig.1 Parent scan of desfuroylceftiofur

圖2 脫呋喃甲?；^孢噻呋的子離子掃描圖Fig.2 Daughter scan of desfuroylceftiofur

圖3 脫呋喃甲?；^孢噻呋的總離子流色譜圖Fig.3 Total ions chromatogram of desfuroylceftiofur

2.3 脫呋喃甲酰基頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

將脫呋喃甲?；^孢噻呋儲(chǔ)備液稀釋以后，進(jìn)行檢測(cè)得出了脫呋喃甲酰基頭孢噻呋的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖4所示，在脫呋喃甲?；^孢噻呋為2～200ng/m L期間，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好，相關(guān)系數(shù)為0.9991。

圖4 脫呋喃甲酰基頭孢噻呋的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Calibration curve of desfuroylceftiofur

2.4 方法的專屬性

在上述分析條件下，空白、加標(biāo)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見(jiàn)圖5～圖7，圖5和圖6對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)空白樣品中的物質(zhì)對(duì)脫呋喃甲酰基頭孢噻呋的檢測(cè)沒(méi)有干擾，從圖7我們可以看出，脫呋喃甲?；^孢噻呋的保留時(shí)間是3.0min。

圖5 空白奶樣色譜圖Fig.5 Chromatogram of blank milk samples

圖6 空白奶樣+頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.6 Chromatogram ofblankmilk samplewith desfuroylceftiofur

圖7 頭孢噻呋標(biāo)準(zhǔn)工作液色譜圖Fig.7 Chromatogram of desfuroylceftiofur

2.5 精確度和準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)

分別選取了高、中、低三個(gè)濃度梯度脫呋喃甲?；^孢噻呋，做日內(nèi)和日間準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，該方法準(zhǔn)確度為2.5～3.4，精確度為2.51%～3.87%，準(zhǔn)確度良好，精確度符合實(shí)驗(yàn)要求。

表2 脫呋喃甲?；^孢噻呋在牛奶中的精密度和準(zhǔn)確度Table 2 Determination of precision and accuracy ofdesfuroylceftiofur in blank milk

2.6 方法回收率實(shí)驗(yàn)

向空白牛奶中加入標(biāo)準(zhǔn)脫呋喃甲?；^孢噻呋溶液，使脫呋喃甲?；^孢噻呋濃度為25、100、200ng/m L，并上機(jī)測(cè)定，得出方法回收率見(jiàn)表3。

表3 牛奶中脫呋喃甲?；^孢噻呋的方法回收率Table 3 Determination of recovery of desfuroylceftiofur in blank milk

2.7 靈敏度實(shí)驗(yàn)

根據(jù)信噪比（S/N）的值來(lái)確定最低定性檢測(cè)限和最低定量檢測(cè)限，結(jié)果表明該方法最低定性檢出限為0.45ng/m L，定量檢出限為1.25ng/m L。

3 結(jié)論

本文建立了脫呋喃甲酰基頭孢噻呋在原料奶中殘留檢測(cè)的UPLC-MS/MS方法，采用梯度洗脫，色譜條件及質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化后，發(fā)現(xiàn)圖譜基線平穩(wěn)，脫呋喃甲酰基頭孢噻呋的保留時(shí)間大約為3m in，且脫呋喃甲?；^孢噻呋有較大的吸收峰，可以與原料奶中其他的雜質(zhì)組分分離良好，該方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高，方法學(xué)考察驗(yàn)證了方法的準(zhǔn)確性和可靠性，檢測(cè)限為0.45ng/m L，可以滿足目前國(guó)內(nèi)外對(duì)原料奶中脫呋喃甲酰基頭孢噻呋殘留的檢測(cè)要求。

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Establishment on UPLC-MS/MS detection methods fordesfuroylceftiofur in raw milk

ZHAO Jing1，2，LIU Peng2，*，QIAN Lei1，*
（1.Food and Environmental Engineering Department，Heilongjiang East College，Harbin 150086，China；2.National Research Center of Dairy Engineering and Technology，Harbin 150086，China）

Objective：A ultra-high pressure liquid chromatograph-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）was established for determination of desfuroylceftiofur residues in raw milk. Methods：T3 column was used witha mixed solution of 0.02% formic acid -acetonitrile as mobile phase. The cefliofur in bovine raw milk wasdecomposed by dithioerythritol to produce desfuroylceftiofur（DFC），which was further stabilized by derivatizationto desfuroylceftiofur acetamide（DCA） using iodoacetamide，then the samples were concentrated and purifiedby HLB SPE cartridge and determined by UPLC-MS/MS．Results：The quantitative ion was m/z 430.12＞125.79.The qualitative ion was m/z 430.12＞241.04． The recovery were 98.6%～102.2%，the relative standard deviations（RSD） were 2.51%～3.87%，the minimum detectable values were 0.45ng/mL. Conclusion：This method could beused for the routine analysis of desfuroylceftiofur residues in raw milk.

UPLC-MS/MS；desfuroylceftiofur；raw m ilk

TS201.1

：A

：1002-0306（2014）16-0092-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.16.011

2013－12－05 *通訊聯(lián)系人

趙靜（1989-），女，在讀碩士研究生，研究方向：乳品質(zhì)量與安全。