梁寶東，魏海香，王田田，張曉晶

（濟(jì)寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系，山東曲阜273155）

響應(yīng)面法優(yōu)化魚骨中硫酸軟骨素的醇沉工藝

梁寶東，魏海香，王田田，張曉晶

（濟(jì)寧學(xué)院生命科學(xué)與工程系，山東曲阜273155）

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法優(yōu)化魚骨中硫酸軟骨素的醇沉工藝參數(shù)。以乙酸鈉質(zhì)量濃度、pH值、乙醇體積分?jǐn)?shù)為考察因素，硫酸軟骨素得率為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平中心組合設(shè)計(jì)(CCD)試驗(yàn)，獲得多元二次回歸方程。結(jié)果表明，硫酸軟骨素的最佳醇沉工藝為乙酸鈉質(zhì)量濃度4.0 g/100 mL、pH值為6.0、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，硫酸軟骨素實(shí)際提取率為1.910%。

魚骨；硫酸軟骨素；響應(yīng)面分析法；醇沉

硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）是從動(dòng)物軟骨組織中提取純化出的一種酸性黏多糖，主要來(lái)源于豬、牛及鯊魚等生物體，但家畜的軟骨產(chǎn)量很低，提取成本高[1]。CS在魚類軟骨中含量很豐富，如鯊魚骨中含50%～60%，但鯊魚由于捕撈過(guò)度而產(chǎn)量銳減，致使硫酸軟骨素生產(chǎn)受到影響。目前全世界每年硫酸軟骨素的產(chǎn)量?jī)H為180 t左右，供不應(yīng)求，已給藥品和化妝品的生產(chǎn)帶來(lái)了影響[2-3]。

我國(guó)魚頭魚骨資源相當(dāng)豐富，從中提取硫酸軟骨素，既能減輕廢棄?mèng)~頭魚骨對(duì)環(huán)境造成的可能污染，又能使硫酸軟骨素產(chǎn)量大幅增加；既可緩解市場(chǎng)緊缺問(wèn)題，又可出口創(chuàng)匯[4]。李川等[5]采用稀堿-酶解工藝對(duì)羅非魚頭中的硫酸軟骨素進(jìn)行了提取，純度達(dá)81.28%，證明了方法的可行性。李瑞國(guó)[6]對(duì)硫酸軟骨素的生產(chǎn)工藝進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)比較和改進(jìn)，發(fā)現(xiàn)應(yīng)避免濃堿提取和高溫，浸提液中的離子強(qiáng)度較大時(shí)有利于提高產(chǎn)品質(zhì)量。陳紅麗等[7]對(duì)硫酸軟骨素的生產(chǎn)工藝進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)堿提取和酶提取是提高得率和純度的兩個(gè)關(guān)鍵步驟。目前從魚骨中提取硫酸軟骨素的研究更多地側(cè)重于提取方法方面的研究。本研究以微山湖區(qū)產(chǎn)四鼻鯉魚魚骨為原料，經(jīng)過(guò)堿法提取和酶解得到浸提液，主要對(duì)浸提液中硫酸軟骨素的醇沉純化工藝進(jìn)行了優(yōu)化，旨在為魚骨硫酸軟骨素的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

魚脊骨、魚頭骨：市售。

1.1.2 試劑

復(fù)合蛋白酶（3.8×105U/g）、咔唑（分析純）、四硼酸鈉（分析純）：上海士鋒生物科技有限公司；氫氧化鈉（分析純）：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；鹽酸（36%）、硫酸（分析純）：萊陽(yáng)市經(jīng)濟(jì)開(kāi)發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠；氯化鈉（分析純）：上海廣諾化學(xué)科技有限公司；三氯乙酸（分析純）：西隴化工股份有限公司；無(wú)水乙醇（分析純）、體積分?jǐn)?shù)為95%乙醇（分析純）：煙臺(tái)市雙雙化工有限公司；粒狀活性炭：天津市福晨化學(xué)試劑廠；無(wú)水乙酸鈉（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司；硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品（≥98%）：上海明圻化學(xué)試劑有限公司。

硼砂-硫酸試劑配制：四硼酸鈉0.953 4 g用濃硫酸定容至100 mL。

咔唑試劑配制：咔唑0.125 0 g用乙醇定容至100 mL，4℃低溫保存。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9059B智能型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上?，槴\實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；723PC可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；XB120A型電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；RJP-350A型快速開(kāi)蓋萬(wàn)能高速粉碎機(jī)：浙江榮浩工貿(mào)有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵：上海亞榮生化儀器廠；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋、TD6離心機(jī)：常州市華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魚骨浸提液的制備

將冷凍狀態(tài)的魚骨流水解凍，投入80℃恒溫蒸煮鍋煮1 h，撈起、洗凈，去除含蛋白質(zhì)、脂肪和其他不需要的部分，于電熱鼓風(fēng)干燥箱中80℃烘干，粉碎，得魚骨骨粉。稱取200 g魚骨粉，與NaOH溶液（1 mol/L）按料液比1∶6（g∶mL）于50℃水浴中恒溫浸提6 h，提取過(guò)程中間歇攪拌，單層紗布過(guò)濾后收集濾液，把濾渣用同樣的方法再處理一次，雙層紗布過(guò)濾，然后把兩次的濾液合并，待處理。調(diào)整濾液pH值至7.0，加入1%的復(fù)合蛋白酶，50℃恒溫水解，酶解時(shí)不斷攪拌，2 h后將酶解液置于90℃水浴鍋中滅酶10 min，水冷迅速降至室溫。把滅活的酶解液pH值調(diào)至6.5，加入活性炭攪拌吸附1 h，靜置片刻后過(guò)濾。將三氯乙酸直接加入到上述濾液中，三氯乙酸的添加量達(dá)10%，邊加邊攪拌即產(chǎn)生沉淀，3 500 r/min離心10 min得上清液，棄沉淀，得魚骨浸提液[8-10]。

1.3.2 浸提液醇沉工藝流程[11-13]

1.3.3 魚骨中硫酸軟骨素含量的測(cè)定

（1）硫酸-咔唑法[14-15]

魚骨中硫酸軟骨素的含量采用硫酸-咔唑法進(jìn)行測(cè)定。

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱量硫酸軟骨素（CS）標(biāo)準(zhǔn)品2 mg，加水溶解并定容至50 mL，配制40 μg/mL的CS標(biāo)準(zhǔn)溶液。準(zhǔn)確吸取CS標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL，分別置于25 mL具塞試管，用蒸餾水定至1 mL混勻，得一系列硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)溶液，在冰水浴條件下緩緩加入5 mL硼砂-硫酸試劑，注意避免出現(xiàn)沸騰。90℃水浴加熱20 min，振蕩混勻，冷水浴中迅速冷卻后，分別加咔唑試劑0.2 mL搖勻，置于90℃水浴加熱20 min，中間振蕩混勻，冷卻至室溫后于波長(zhǎng)530 nm處測(cè)定其吸光度值。

（3）樣品中硫酸軟骨素含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱取樣品3 mg，加15 mL超純水溶解并稀釋，做3個(gè)重復(fù)，以超純水作為參比，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法分別測(cè)定其吸光度值，樣品中硫酸軟骨素提取率計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

以硫酸軟骨素（CS）質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸方程為y=0.009 0x+0.005 7，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 1，表明二者線性關(guān)系良好。

圖1 硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of chondroitin sulfate

2.2 乙酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)硫酸軟骨素醇沉效果的影響

在5個(gè)三角瓶中分別加入100 mL魚骨浸提液，分別加入乙酸鈉質(zhì)量濃度為3.5 g/100 mL、4.0 g/100 mL、4.5 g/100 mL、5.0 g/100 mL、5.5 g/100 mL，攪拌溶解后調(diào)節(jié)溶液pH值為6.0，冷卻后加入一定無(wú)水乙醇使體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，4℃下靜置12 h后于5 000 r/min離心20 min，收集沉淀，考察乙酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)硫酸軟骨素醇沉效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 乙酸鈉質(zhì)量濃度對(duì)硫酸軟骨素提取率的影響Fig.2 Effect of sodium acetate concentration on extraction yield of chondroitin sulfate

由圖2可以看出，隨著乙酸鈉質(zhì)量濃度的增大，硫酸軟骨素提取率逐漸提高，在乙酸鈉質(zhì)量濃度為4.5 g/100 mL時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)乙酸鈉質(zhì)量濃度＞4.5 g/100 mL時(shí)，硫酸軟骨素的提取率出現(xiàn)下降趨勢(shì)，硫酸軟骨素提取率由2.03%下降到1.23%。這是因?yàn)楫?dāng)鹽離子濃度過(guò)大時(shí)導(dǎo)致一些雜質(zhì)（某些蛋白質(zhì)和有機(jī)鹽）溶出率增大繼而降低就了硫酸軟骨素的析出，使硫酸軟骨素的提取率降低。因此，乙酸鈉最佳質(zhì)量濃度為4.5 g/100 mL。

2.3 pH對(duì)硫酸軟骨素醇沉效果的影響

在5個(gè)三角瓶中分別加入100 mL魚骨浸提液，在提取液中加入無(wú)水乙酸鈉，攪拌溶解使體系的乙酸鈉質(zhì)量濃度為4.5 g/100 mL，分別調(diào)節(jié)提取液pH為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，冷卻后加入無(wú)水乙醇使體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，4℃下靜置12 h，5 000 r/min離心20 min，收集沉淀，考察pH值對(duì)硫酸軟骨素醇沉效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 pH對(duì)硫酸軟骨素提取率的影響Fig.3 Effect of pH on extraction yield of chondroitin sulfate

由圖3可以看出，隨著pH的增大，硫酸軟骨素提取率逐漸提高。在pH約為6.0時(shí)達(dá)到最大值，當(dāng)pH＞6.0時(shí)硫酸軟骨素的提取率開(kāi)始降低，由1.87%降到1.49%。這是因?yàn)榱蛩彳浌撬貙儆趦尚曰衔铮琾H的變化會(huì)影響其所帶電荷的性質(zhì)和數(shù)量，進(jìn)而影響其在純化過(guò)程中的溶解度，當(dāng)靜電荷數(shù)減少時(shí)，分子間吸引力增加，相互凝聚產(chǎn)生沉淀，使硫酸軟骨素的提取率降低。因此，最佳pH值為6.0。

2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)硫酸軟骨素醇沉效果的影響

在5個(gè)三角瓶中分別加入100 mL魚骨浸提液，在提取液中加入無(wú)水乙酸鈉，攪拌溶解使體系的乙酸鈉質(zhì)量濃度為4.5 g/100 mL，調(diào)節(jié)提取液pH值為6.0并冷卻后加入無(wú)水乙醇使體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%、60%、65%、70%、75%，4℃靜置12 h，5 000 r/min離心20 min，收集沉淀，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)硫酸軟骨素醇沉效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸增大，硫酸軟骨素的提取率逐漸提高，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%時(shí)提取率達(dá)到最大值（1.98%），在55%～65%時(shí)變化較明顯，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)＞65%時(shí)，提取率開(kāi)始降低，乙醇體積分?jǐn)?shù)為75%時(shí)，提取率為1.3%。這是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，提高了某些蛋白質(zhì)的溶解度，使硫酸軟骨素也隨之溶于乙醇溶液而沒(méi)有沉降下來(lái)。因此，最佳乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)硫酸軟骨素提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol content on extraction yield of chondroitin sulfate

2.5 魚骨中硫酸軟骨素醇沉條件的響應(yīng)面分析與優(yōu)化

根據(jù)Box-Benhnken中心設(shè)計(jì)原理，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，以無(wú)水乙酸鈉質(zhì)量濃度（A）、pH值（B）、和乙醇體積分?jǐn)?shù)（C）三因素為自變量，以硫酸軟骨素提取率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平試驗(yàn)，因素和水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology

2.6 響應(yīng)面方差分析

用Design-Expert程序?qū)Ρ?試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3，并得出回歸方程如下：

模型的校正決定系數(shù)R2Adj為0.929 0，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為5.08%，說(shuō)明該模型只有7.10%的變異不能由該模型解釋，因此，該模型的擬合性較好。模型的F值為13.39，P＜0.000 1，表明該模型受外界干擾的幾率只有0.01%，是極其顯著的，模型擬合程度較好，自變量與響應(yīng)值之間的線性關(guān)系顯著，可用于硫酸軟骨素純化工藝的預(yù)測(cè)和分析。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3得出，C、交互項(xiàng)BC、B2和C2對(duì)硫酸軟骨素提取率有顯著影響；A2對(duì)硫酸軟骨素得率影響高度顯著，而A、B、AB和AC對(duì)硫酸軟骨素得率的影響都不顯著。在所選的各因素范圍內(nèi)，對(duì)硫酸軟骨素純化的影響排序?yàn)閜H值（C）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）＞乙酸鈉質(zhì)量濃度（A）。

2.7 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化

通過(guò)Design-Expert軟件繪制響應(yīng)面曲線圖與等高線圖進(jìn)行分析可進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用以及最優(yōu)點(diǎn)，結(jié)果見(jiàn)圖5。

由圖5A可以看出，pH值為6.0時(shí)乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)硫酸軟骨素的純化影響較為顯著，硫酸軟骨素的提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高先升高再降低，這可能是由于乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，提高了某些蛋白質(zhì)的溶解度，使硫酸軟骨素也隨之溶于乙醇溶液而又沉降下來(lái)[8]。在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，乙酸鈉質(zhì)量濃度和乙醇體積分?jǐn)?shù)分別在4.0～5.0 g/100 mL和60%～70%范圍內(nèi)時(shí)，硫酸軟骨素提取率可以達(dá)到最大值。

由圖5B可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，pH值對(duì)硫酸軟骨素的純化影響較為顯著，硫酸軟骨素的提取率隨pH的升高先升高再降低。在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，乙酸鈉質(zhì)量濃度和pH分別在4.0～5.0 g/100 mL和6.0～7.0范圍內(nèi)時(shí)，硫酸軟骨素提取率可以達(dá)到最大值。

由圖5C可以看出，乙酸鈉質(zhì)量濃度為4.5 g/100 mL時(shí)，硫酸軟骨素提取率隨乙醇體積分?jǐn)?shù)和pH值的升高先升高再降低。在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，乙醇體積分?jǐn)?shù)和pH分別在60%～70%和6.0～7.0范圍內(nèi)時(shí)，硫酸軟骨素提取率可以達(dá)到最大值。

2.8 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)Design-Expert軟件分析得出3個(gè)影響因素的最佳組合為：乙酸鈉質(zhì)量濃度4.5 g/100 mL，pH值為6.0，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，該條件下硫酸軟骨素純化的提取率預(yù)測(cè)值為1.925%。為檢驗(yàn)其可靠性，在該條件下重復(fù)試驗(yàn)3次，硫酸軟骨素純化的提取率為1.910%，實(shí)測(cè)值與理論值基本吻合，說(shuō)明響應(yīng)面分析法得到的硫酸軟骨素純化工藝條件真實(shí)可靠，具有一定實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論

本研究采用了從魚骨中提取硫酸軟骨素的醇沉工藝，采用單因素和響應(yīng)面分析相結(jié)合的方法，分別考察了乙酸鈉質(zhì)量濃度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和pH等因素對(duì)硫酸軟骨素醇沉工藝的影響，得到硫酸軟骨素最佳醇沉工藝：乙酸鈉質(zhì)量濃度4.5 g/100 mL，pH值為6.0，乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，各因素的主效應(yīng)關(guān)系為：pH（C）＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）＞乙酸鈉質(zhì)量濃度（A）。此條件下硫酸軟骨素的提取率為1.910%。

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Optimization of alcohol precipitation process of chondroitin sulfate from fishbone by response surface methodology

LIANG Baodong,WEI Haixiang,WANG Tiantian,ZHANG Xiaojing
(Department of Life Science and Engineering,Jining University,Qufu 273155,China)

On the basis of single factor experiment,response surface methodology was used to optimize alcohol precipitation process of chondroitin sulfate from fishbone.Using sodium acetate concentration,pH value and ethanol concentration as investigation factors and chondroitin sulfate extraction ratio as response value,the optimal purification conditions were explored through a three-factor,three-level central composite experimental design and the multiple quadratic regression equation was acquired.Results showed that the optimum alcohol precipitation process of chondroitin sulfate from fishbone was as follows:sodium acetate concentration 4.0 g/100 ml,pH 6.0,ethanol concentration 60%.The chondroitin sulfate extraction ratio was 1.910%.

fishbone;chondroitin sulfate;response surface methodology;alcohol precipitation

TS254.9

A

0254-5071（2014）10-0104-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.025

2014-08-27

濟(jì)寧學(xué)院大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)與創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目（CXL305）

梁寶東（1979-），男，講師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵及生物活性物質(zhì)。