趙偉，段瑩瑩，張?jiān)惠x，曹大鵬，周生民，馮文紅

（山東福洋生物科技有限公司，山東德州253100）

HPLC法檢測(cè)海藻糖的研究

趙偉，段瑩瑩，張?jiān)惠x*，曹大鵬，周生民，馮文紅

（山東福洋生物科技有限公司，山東德州253100）

建立了一種利用高效液相色譜法檢測(cè)葡萄糖、麥芽糖和海藻糖混合溶液中海藻糖的方法。采用Xbridge-NH2色譜柱，流動(dòng)相為乙腈/水=4∶1加0.1%的氨水，流速1.0 mL/min，柱溫35℃，該條件下葡萄糖、麥芽糖、海藻糖能完全分開，葡萄糖、麥芽糖、海藻糖的質(zhì)量濃度在0.1～4.0 g/100 mL范圍與峰面積呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 8～0.999 9，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.60%，回收率為98.2%～99.4%。

高效液相色譜法；檢測(cè)；海藻糖；混合溶液

海藻糖是一種被稱為生命之糖的非還原性二糖，有使細(xì)胞膜及蛋白質(zhì)等生物大分子穩(wěn)定的作用[1]，能使干燥脫水后的生物體以極低乃至停止新陳代謝的形式被保護(hù)，一旦環(huán)境許可，生物體即能復(fù)活，而不損害生命物質(zhì)[2]。海藻糖能保護(hù)酵母菌的胞吞作用不受其產(chǎn)生的酒精的抑制[3]，海藻糖的強(qiáng)表達(dá)能提高在高滲透壓下大腸桿菌的生長能力[4]，海藻糖在食品、醫(yī)藥、保健、化妝品以及農(nóng)作物育種方面也有廣泛的應(yīng)用[5]。海藻糖的生物合成方法有利用生物自然合成[6-8]和酶法合成[9-13]。海藻糖合成酶是由NISHIMOTO T等[13]從脂肪桿菌屬（Pimelobacter sp.）R48和水生棲熱菌（Thermus aquaticus）中最早發(fā)現(xiàn)并提純的。國際上，日本等國以淀粉為原料，通過酶法反應(yīng)成功進(jìn)行了海藻糖的工業(yè)化生產(chǎn)，為其的進(jìn)一步應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)[2]。海藻糖轉(zhuǎn)化酶能夠?qū)Ⅺ溠刻寝D(zhuǎn)化為海藻糖[10]。有很多方法可以對(duì)海藻糖的含量進(jìn)行測(cè)量，如高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[6-12]、蒽酮-硫酸法[13]、3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法[14]等，但是這些方法不能簡(jiǎn)便準(zhǔn)確的測(cè)定溶液中海藻糖、麥芽糖和葡萄糖的含量。為了對(duì)海藻糖轉(zhuǎn)化酶的反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，需要測(cè)定海藻糖轉(zhuǎn)化率，本研究用示差折光檢測(cè)器和氨基柱的高效液相色譜法對(duì)溶液中海藻糖所占比例進(jìn)行測(cè)定，該方法能夠準(zhǔn)確測(cè)定混合溶液中海藻糖，麥芽糖和葡萄糖各自的含量，比其他方法更加簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，以期為海藻糖工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海藻糖、麥芽糖、葡萄糖：美國Sigma公司；乙腈（色譜純）：西隴化工股份有限公司；氨水：萊陽市康德化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20 AT型HPLC色譜儀（配Waters515泵、Waters 2414型示差折光檢測(cè)器、N2000雙通道色譜工作站、柱溫控制系統(tǒng)）：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：XBridgeTMNH2（3.5 μm×4.6 μm×250 mm）；柱溫：35℃；流動(dòng)相：V乙腈∶V水=4∶1，配好后加0.1%氨水；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)器溫度：40℃。

1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取葡萄糖、麥芽糖、海藻糖各1.000 0 g，將這三種糖定容至100 mL容量瓶中，搖勻后超聲混勻20 min，進(jìn)樣前用0.22 μm的濾膜過濾。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

用超純水分別配制質(zhì)量濃度分別為0.1 g/100 mL、0.2 g/100 mL、0.4 g/100 mL、0.8 g/100 mL、1.6 g/100 mL、3.2 g/ 100mL、4.0g/100mL葡萄糖、麥芽糖、海藻糖的標(biāo)準(zhǔn)溶液，HPLC分析后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)（R2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)條件的確定

文獻(xiàn)中測(cè)定海藻糖一般用氨基柱，流動(dòng)相為V乙腈∶V水為4∶1，流速為1 mL/min，但是本試驗(yàn)用Xbridge-NH2色譜柱時(shí)測(cè)得的麥芽糖和海藻糖均為駝峰，在流動(dòng)相中加入0.1%的氨水后，駝峰消失，峰型良好，由于氨水易揮發(fā)，不會(huì)對(duì)儀器設(shè)備產(chǎn)生影響，因此本試驗(yàn)選用其作為胺修飾劑，葡萄糖、麥芽糖和海藻糖的分離效果好，能夠準(zhǔn)確的測(cè)量各糖的含量，滿足分析溶液中海藻糖的含量。

2.2 組分的定性定量分析

分別進(jìn)1%的葡萄糖、麥芽糖和海藻糖的標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)保留時(shí)間定性分析，根據(jù)外標(biāo)法進(jìn)行定量分析，然后進(jìn)混合標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)果分離度良好，混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standards

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程

以糖質(zhì)量濃度（x，g/100 mL）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，葡萄糖、麥芽糖及海藻糖HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，相關(guān)系數(shù)與回歸方程見表1。

由表1可知，葡萄糖、麥芽糖、海藻糖的質(zhì)量濃度為0.1～4.0 g/100 mL時(shí)與峰面積呈良好線性，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 8～0.999 9。

2.4 精密度試驗(yàn)

對(duì)海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品所配溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積，結(jié)果見表2。

圖2 葡萄糖(A)、麥芽糖(B)及海藻糖(C)的HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve for HPLC analysis of glucose(A),maltose(B) and trehalose(C)

表1 相關(guān)系數(shù)與線性方程Table 1 Correlation coefficient and linear equation

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of precision test

由表2可知，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為1.60%，在5.0%誤差范圍內(nèi)，說明該方法精密度良好。

2.5 回收率試驗(yàn)

取三份樣品分別加葡萄糖、麥芽糖、海藻糖標(biāo)準(zhǔn)品，回收率結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of recovery test

由表3可知，這三種糖的回收率為98.2%～99.4%，符合回收率在95%～105%的標(biāo)準(zhǔn)，說明該方法具有較好的準(zhǔn)確度。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)建立了用Xbridge-NH2色譜柱測(cè)定海藻糖的HPLC方法，同時(shí)摸索出使葡萄糖、麥芽糖、海藻糖三種混合物完全分離的測(cè)定方法，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 8～0.999 9，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.60%，回收率為98.2%～99.4%。該法簡(jiǎn)單快捷、靈敏度高、重現(xiàn)性好，可用于研究或生產(chǎn)海藻糖的含量測(cè)定。

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Determination of trehalose by HPLC

ZHAO Wei,DUAN Yingying,ZHANG Yuehui*,CAO Dapeng,ZHOU Shengmin,FENG Wenhong
(Shangdong Fuyang Biotechnology Co.,Ltd.,Dezhou 253100,China)

A HPLC method for the detection of trehalose in the mix solution of glucose,maltose and trehalose was established.The sample was separated by Xbridge-NH2chromatographic column,using acetonitrile:water=4∶1 supplemented with 0.1%NH4OH as the mobile phase,the flow rate 1.0 ml/min,the column temperature 35℃.Under this condition,glucose,maltose,and trehalose were completely separated.When the concentration of glucose,maltose,trehalose was in the range of 0.1-4.0 g/100 ml,the concentration and the peak area had a good linear relationship,R2was 0.999 8-0.999 9,relative standard deviation was 1.60%,and the recovery rate was 98.2%-99.4%.

HPLC;detection;trehalose;mixed solution

O657.7

A

0254-5071（2014）10-0148-03

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.10.036

2014-09-01

趙偉（1979-），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锇l(fā)酵。

*通訊作者：張?jiān)惠x（1987-），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)槲⑸锱c酶技術(shù)。