張育森，常彩紅，張 悅，李富榮，鮑世韻

(1深圳市人民醫(yī)院，暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東深圳518020;2海南醫(yī)學(xué)院)

胰島移植是治療1型糖尿病(特別是有嚴重低血糖史和代謝不穩(wěn)定)患者的有效方法之一。隨著埃德蒙頓方案的提出，胰島移植再次成為關(guān)注熱點［1～3］。由于胰島分離技術(shù)復(fù)雜、分離時間較長，加之移植后短時間內(nèi)不能建立血供，易在受體內(nèi)凋亡和死亡;因此，常需2～3個供體分離的胰島才能使糖尿病患者完全脫離胰島素治療。如何對分離損傷的胰島進行修復(fù)和保護、降低胰島使用量，在胰島移植臨床工作中具有重要意義。2007年7月～2009年6月，我們觀察了胎鼠胰腺干細胞體外對胰島的保護作用及對移植效果的影響，旨在為臨床胰島移植提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料 ①動物:孕16 d的SD大鼠1只(體質(zhì)量500 g)、10周齡SD大鼠60只(體質(zhì)量200～250 g，雌雄不限)，均由廣東省實驗動物中心提供［動物合格證:SCXK(粵)2003-0002)］。②主要試劑:DMEM培養(yǎng)粉(低糖)、胎牛血清均為Gibco公司產(chǎn)品;Hank＇s液(Hyclone公司產(chǎn)品);膠原酶Ⅴ、吖啶橙(AO)、碘化丙啶(PI)、膠原酶Ⅴ、胰蛋白酶、雙硫腙及鏈脲佐菌素(STZ)均為Sigma公司產(chǎn)品;Ficoll-400(Pharmacia公司);新生牛血清(四季清公司);大鼠胰島素ELISA試劑盒(Mercodia公司);巢蛋白(Nestin)單克隆抗體、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記抗小鼠二抗(Chemicon公司);Epics Altra流式細胞儀(Beckman Coulter公司);快速血糖測試儀(強生公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 胎鼠胰腺干細胞分離、純化和培養(yǎng) 將孕16 d大鼠經(jīng)麻醉后行剖宮產(chǎn)術(shù)，取出胎鼠。沿胎鼠腹部正中切開腹壁，暴露白色的胰芽并切取;以眼科剪將胰芽稍加修剪，接種于培養(yǎng)瓶中，加入DMEM培養(yǎng)基(含體積分數(shù)為10%的胎牛血清)，置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng);細胞傳代3次后涂片，流式細胞術(shù)測定Nestin陽性細胞數(shù);取第5代胰腺干細胞消化，調(diào)整細胞密度為1×105/mL，接種于24孔培養(yǎng)板中，待用。

1.2.2 胰島的分離與純化 10周齡大鼠禁食12 h，充分暴露胰腺。取質(zhì)量濃度1 g/L的膠原酶Ⅴ溶液(Hank＇s液配制)6 mL經(jīng)膽總管逆行注入，使胰腺完全膨脹，完整切取胰腺，置同上膠原酶Ⅴ溶液中，37℃水浴中消化9 min;以4℃、10%新生牛血清的Hank＇s液中止消化;洗滌過濾;采用Ficoll不連續(xù)密度梯度離心法進行胰島純化。收集質(zhì)量濃度1.096、1.067 kg/L及1.067、1.034 kg/L的Ficoll界面細胞團，取200μL消化液雙硫腙染色計數(shù);洗滌后在顯微鏡下手挑法選取直徑在50μm以上的胰島。

1.2.3 糖尿病大鼠模型制備 以pH值為4.4的枸櫞酸鈉緩沖液溶解STZ，取10周齡同批次200～250 g雌性SD大鼠20只，按60 mg/kg腹腔注射STZ;尾靜脈末梢采血快速檢測血糖，以大鼠出現(xiàn)多飲、多尿，隨機血糖＞16.7 mmol/L并維持3 d以上作為建模成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 胰島分組培養(yǎng)及胰島細胞凋亡率、胰島活性、胰島分泌量檢測 將上述純化后的胰島分為A組和B組，其中A組按每孔20個胰島(直徑＞50μm)接種于24孔培養(yǎng)板;B組按上述比例接種于含胎鼠胰腺干細胞的24孔培養(yǎng)板。兩組均按照文獻［4，5］培養(yǎng):加入DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。培養(yǎng)過程中觀察胰島形態(tài)及生長狀況，第3、7天分別以Annexin-V/7-ADD定量分析法檢測胰島細胞凋亡率;第3、7、14天分別以AO-PI雙染色法檢測胰島活率(壞死胰島呈紅色，存活胰島呈綠色)，ELISA法檢測胰島分泌量，通過高糖(16.7 mmol/L)刺激試驗計算刺激指數(shù)(高糖刺激后分泌量與基礎(chǔ)分泌量之比)。

1.2.5 胰島移植術(shù)后血糖監(jiān)測 取兩組培養(yǎng)7 d懸浮生長的胰島各800個移植入糖尿病大鼠左腎包膜下，術(shù)后每天尾靜脈采血以快速血糖測試儀檢測血糖。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以±s表示，比較用兩樣本t檢驗分析及重復(fù)測量設(shè)計的方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胎鼠胰腺干細胞鑒定情況 第3代細胞消化、涂片及免疫組化染色后可見Nestin陽性細胞，流式細胞術(shù)測定其含量占74.1%。

2.2 胰島分離純化結(jié)果 雙硫腙染色后胰島呈猩紅色，圓形或橢圓形，大小不等。40只大鼠平均每只胰腺消化后獲得(654±41)個胰島，F(xiàn)icoll純化后獲得(410 ±32)個胰島;平均回收率為58.1%，純度為95%。

2.3 體外培養(yǎng)過程中胰島形態(tài)、生長狀況、存活率、細胞凋亡率、胰島素分泌量及刺激指數(shù) ①形態(tài)、生長狀況:胰島懸浮于培養(yǎng)基中，圓形或橢圓形，大小不等，輪廓清晰，立體感強。其中A組培養(yǎng)第3天時胰島生長狀況較好、輪廓清楚，培養(yǎng)第7天時胰島結(jié)構(gòu)變松散、邊界不清，培養(yǎng)＞14 d后胰島結(jié)構(gòu)均已破壞;B組培養(yǎng)第3天時胰島生長良好、部分與貼壁干細胞松散黏附(振蕩后可重新懸浮)，培養(yǎng)第14天時仍可見完整胰島。②存活率:培養(yǎng)第3、7、14天時胰島存活率A組分別為91%±4%、40%± 6%、6%±4%，B組分別為94%±5%、69%±7%、40%±8%，培養(yǎng)第7、14天時B組胰島存活率顯著高于 A組，P均 ＜0.01(t值分別為 -7.250、-8.570)。③細胞凋亡率:培養(yǎng)第3、7天時胰島細胞凋亡率A組分別為11.3%±4.3%、33.5%± 7.9%，B組分別為9.1%±3.5%、23.3%±5.9%，培養(yǎng)第7天時B組胰島細胞凋亡率顯著低于A組，P＜0.05(t=-2.316)。④胰島素分泌量及刺激指數(shù):詳見表1。其中A組培養(yǎng)第14天時胰島素含量低于檢出限(標(biāo)注為-)。

表1 兩組胰島素分泌量與刺激指數(shù)比較(±s)

表1 兩組胰島素分泌量與刺激指數(shù)比較(±s)

注:與同時間A組比較，*P＜0.01(t值高糖刺激后胰島素分泌量分別為8.479、36.118，刺激指數(shù)分別為3.648、12.505)

組別 基礎(chǔ)胰島素分泌量(ng/L)高糖刺激后胰島素分泌量(ng/L)刺激指數(shù)B 組培養(yǎng)3 d 326.3±19.5 640.3±32.4 2.01±0.17培養(yǎng)7 d 293.0±23.9 571.4±42.5* 1.95±0.24*培養(yǎng)14 d 271.1±15.1 410.8±19.7* 1.52±0.21* A組培養(yǎng)3 d 316.6±35.1 611.4±26.4 1.93±0.15培養(yǎng)7 d 260.1±30.1 392.8±20.2 1.51±0.13培養(yǎng)14 d- - -

2.4 胰島移植后血糖變化 B組胰島移植后5 d內(nèi)大鼠血糖降至正常水平并維持約1周，而A組胰島移植后大鼠血糖未降至正常水平。經(jīng)重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，兩組移植后血糖隨時間變化的趨勢不同(F=43.03，P＜0.01)，B組血糖下降幅度更明顯(F=413.67，P＜0.01)。詳見圖1。

圖1 胰島移植后兩組血糖變化

3 討論

如何保護胰島功能一直是胰島移植中一個重要的研究內(nèi)容。最近很多研究表明，干細胞除了自身具有較強的增殖分化能力之外，還可通過分泌細胞因子或者通過細胞—細胞接觸、融合等方式促進損傷組織修復(fù)、促進細胞成熟和增殖，進而維持正常組織細胞的功能。比如間充質(zhì)干細胞可通過轉(zhuǎn)分化提供細胞因子，增強組織內(nèi)源性前體細胞增殖、細胞融合或者線粒體的轉(zhuǎn)運而起到修復(fù)損傷組織的作用［6～12］。Lee等［10］將間充質(zhì)干細胞注入糖尿病小鼠體內(nèi)后，發(fā)現(xiàn)其可在受損的胰腺富集并促進小鼠胰島分泌更多的胰島素。胚胎干細胞可通過分泌胰島素樣生長因子1(IGF-1)和wnt5α信號通路逆轉(zhuǎn)Id敲除小鼠的心肌表型，改善預(yù)后(Id敲除小鼠存在先天多發(fā)性心臟缺陷，胚胎多于孕13.5 d前流產(chǎn))［14］;胚胎生殖細胞可通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子α及腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子促進受損運動神經(jīng)元的恢復(fù)［15］;Llado等［16］發(fā)現(xiàn)，將神經(jīng)祖細胞與臨近部位的成熟神經(jīng)元共培養(yǎng)時，神經(jīng)祖細胞可通過分泌神經(jīng)生長因子等促進神經(jīng)元軸突生長、保護神經(jīng)元免受外源性毒素的損傷，延長神經(jīng)元壽命。上述研究為利用干細胞保護成熟組織細胞、促進損傷后組織細胞修復(fù)及組織細胞再生等提供了依據(jù)。

由于胰島分離及移植后血供建立困難等常引起胰島凋亡和死亡，利用干細胞對分離損傷的胰島進行修復(fù)和保護在胰島移植工作中具有重要意義。通過修復(fù)損傷胰島而保護胰島的活性、提高胰島的質(zhì)量，可能提高胰島移植的療效，同時降低胰島需要量，達到一對一移植治療糖尿病的目標(biāo)，從而推動胰島移植的更廣泛開展。利用干細胞分泌的某些細胞因子或通過細胞—細胞接觸等作用修復(fù)損傷胰島，保護胰島的活性，延長胰島體外存活時間可能是一種很好的方法。本實驗顯示，將胎鼠胰腺來源的干細胞與胰島共培養(yǎng)可明顯延長胰島體外存活時間、增加高糖刺激下胰島素分泌量及刺激指數(shù)，且移植入糖尿病大鼠左腎包膜下后可將其血糖降至正常。進一步證明與胎鼠胰腺干細胞共培養(yǎng)可保護胰島活性。機制可能與胎鼠來源的胰腺干細胞能分泌各種促進損傷修復(fù)、營養(yǎng)支持的可溶性因子或細胞—細胞接觸作用有關(guān)。

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