于金林　孟衛(wèi)東　孫愛霞　初瑞雪

[摘要] 目的 探討聊城地區(qū)手足口病（HFMD）的病原構(gòu)成及臨床特點(diǎn)。 方法 采集2010年6月聊城地區(qū)240例HFMD患者（包括23例重癥患者）咽拭子并提取病毒RNA。采用real-time RT-PCR方法，以腸道病毒5′UTR區(qū)通用引物及探針對(duì)病毒RNA進(jìn)行初步篩查，初篩陽性標(biāo)本進(jìn)一步采用CA16及EV71 VP1區(qū)特異性引物及探針進(jìn)行型別鑒定。 結(jié)果 普通患者EV71陽性143例、CA16陽性6例、其他腸道病毒陽性21例；重癥患者中EV71陽性率達(dá)82.6%（19/23），CA16感染未見引起重癥。 結(jié)論 聊城地區(qū)HFMD患者以1～3歲兒童為主，男性高發(fā)于女性，農(nóng)村高發(fā)于城市；HFMD的病原包括EV71、CA16及其他腸道病毒，主要病原為EV71，且EV71感染容易引起重癥并發(fā)癥。

[關(guān)鍵詞] 手足口?。豢滤_奇病毒；腸道病毒

[中圖分類號(hào)] R512.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）01（a）-0163-03

手足口?。╤and foot mouth disease，HFMD）是由腸道病毒引起的急性傳染病，常發(fā)生于學(xué)齡前兒童，以<3歲兒童的發(fā)病率最高，表現(xiàn)為發(fā)熱和手、足、口腔、臀、膝等部位的皮疹、斑丘疹，少數(shù)病例可出現(xiàn)無菌性腦膜炎、腦炎、腦脊髓炎、肺水腫、循環(huán)衰竭等并發(fā)癥，個(gè)別出現(xiàn)脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹后遺癥，甚至死亡。腸道病毒為HFMD病原，主要為柯薩奇病毒（Coxsackie virus）A組部分血清型，如A2、A4、A5、A8、A10、A16；部分B組柯薩奇病毒血清型，如B2、B4；埃可病毒（ECHO virus）和腸道病毒（enterovirus）71型，以CA16和EV71型常見。為了解本地區(qū)HFMD病原構(gòu)成及臨床特點(diǎn)，本研究采集一定時(shí)期HFMD患者鼻咽拭子進(jìn)行了real-time RT-PCR檢測(cè)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2010年6月1～9日聊城市人民醫(yī)院HFMD門診依據(jù)原衛(wèi)生部《手足口病診療指南2010年版》診斷為HFMD的240例患者，其中，男143例，女97例；年齡6個(gè)月～40歲（8、12、14、33、40歲各1例），平均3.2歲。輕型患者217例，重癥（并發(fā)腦炎、腦脊髓炎、腦膜炎、肺水腫、循環(huán)衰竭及心肌炎即為重癥）患者23例；并發(fā)腦炎7例，并發(fā)腦炎、肺炎11例，并發(fā)肺炎1例；農(nóng)村178例，城市62例。

1.2 標(biāo)本采集

由專業(yè)醫(yī)護(hù)人員用專用采樣棉簽，適度用力拭采咽后壁和兩側(cè)扁桃體部位，避免觸及舌部，迅速將采樣棉簽放入裝有保存液的外螺旋蓋采樣管中，旋緊管蓋，密封以防止干燥，在采樣管外注明標(biāo)本唯一性編號(hào)。2 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，超低溫（-80℃）冷凍保存。采集鼻咽拭子置病毒保存液中，送實(shí)驗(yàn)室由專業(yè)人員嚴(yán)格按操作程序檢測(cè)。

1.3 標(biāo)本檢測(cè)

咽拭子于標(biāo)本保存液中充分振蕩20 min，洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細(xì)胞等，凍融1次使細(xì)胞破裂，釋放病毒顆粒，并在4℃條件下10 000 r/min離心20 min。采用北京金豪制藥股份有限公司（簡(jiǎn)稱“北京金豪”）生產(chǎn)的核酸分離試劑盒（硅膠膜吸附法），按試劑盒說明書提取病毒RNA。所得RNA首先應(yīng)用針對(duì)腸道病毒5′UTR區(qū)的腸道病毒通用引物熒光檢測(cè)試劑盒（北京金豪）進(jìn)行real time RT-PCR檢測(cè)，陽性標(biāo)本再以分別針對(duì)EV71和CA16 VP1基因的腸道病毒EV71和CA16型雙通道熒光檢測(cè)試劑盒（北京金豪）進(jìn)行型別鑒定。擴(kuò)增體系及循環(huán)程序均參照試劑盒要求，在Roche Light Cycler 480Ⅱ上完成擴(kuò)增。

1.4 結(jié)果的判讀與分析

根據(jù)Roche Light Cycler 480Ⅱ分析軟件進(jìn)行分析，得到各標(biāo)本的腸道病毒通用性RNA的檢測(cè)結(jié)果。每次試驗(yàn)應(yīng)設(shè)置陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，且應(yīng)符合以下要求，否則試驗(yàn)結(jié)果不成立：無Ct值或Ct值為0報(bào)告該反應(yīng)陰性；Ct值≤37.0報(bào)告該反應(yīng)陽性；37.0

2 結(jié)果

<3歲兒童占64.2%，<5歲兒童占87.2%，EV71陽性患者143例，CA16陽性患者6例，其他腸道病毒21例（表1）。19例EV71陽性重癥患者中，農(nóng)村患兒占68%（13/19），城市患兒占32%（6/19）；<1歲患兒中，男5例，女1例；2歲以下患兒男6例、女1例；3歲以下患兒男3例、女0例；4歲以下患兒男女均0例；5歲以下患兒男3例、女0例；男性占89%（17/19），女性占11%（2/19）。

3 討論

HFMD是由腸道病毒感染引起的兒童傳染病，傳染性強(qiáng)，傳播途徑廣，速度快，流行強(qiáng)度大，短期內(nèi)可引起大流行。1957年新西蘭首次報(bào)道HFMD，1958年分離出CA16型病毒。自1972年美國(guó)首次確認(rèn)EV71引起HFMD以來，HFMD在世界各地均有流行，且EV71與CA16病毒感染交替出現(xiàn)，成為HFMD的兩種主要病原體。本研究提示，EV71陽性患者143例，CA16陽性患者6例，其他腸道病毒22例，與上海、深圳、北京等地區(qū)存在差異[1-3]。近年來，馬來西亞、新加坡、香港等地EV71病毒多次大規(guī)模暴發(fā)流行，出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，甚至暴發(fā)性死亡病例[4-6]。EV71病毒耐酸耐熱，耐酸決定其可通過糞-口途徑傳播，耐熱使其能在較高溫度下存活和自我復(fù)制。EV71病毒的復(fù)制能力與神經(jīng)毒性有關(guān)，導(dǎo)致患兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育遲緩和認(rèn)知功能減退，亦可引起成人急性腦炎[7-9]。通過周圍運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突逆向軸漿運(yùn)輸可能是EV71型病毒侵入中樞神經(jīng)的主要途徑[10-11]。本研究提示，本地區(qū)重癥手足口病主要由EV71型腸道病毒引起，CA16病毒未引起重癥感染。CA16病毒陽性較少，這與CA16病毒小范圍傳播及CA16病毒感染后大多數(shù)患者呈隱形攜帶，癥狀較輕，就診者少有關(guān)。本研究證實(shí)，聊城地區(qū)引起HFMD流行的病原主要為EV71和CA16病毒，同時(shí)存在其他型別腸道病毒。

本研究提示，<3歲兒童占64.2%，<5歲兒童占87.2%，男性發(fā)病率高于女性。與文獻(xiàn)報(bào)道聊城地區(qū)HFMD主要集中在<5歲兒童接近，男女比例略有差異，這可能與病例選擇的地域范圍和時(shí)間段不同有關(guān)。而男性患病率高于女性，這與男孩活潑好動(dòng)，衛(wèi)生清潔意識(shí)較弱有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，HFMD患者農(nóng)村與城市比例為2.9∶1，且以<5歲農(nóng)村幼托兒童為主，這與農(nóng)村衛(wèi)生條件差及該年齡段兒童抵抗力弱、相互接觸密切、室內(nèi)通風(fēng)不良易發(fā)生交叉感染等因素有關(guān)。

本研究240例咽拭子中有170例腸道病毒陽性，陽性率為70.8%，另外有70份標(biāo)本腸道病毒陰性，分析其原因，主要有以下幾方面：①腸道病毒為RNA病毒，RNA在外界很容易被核酸酶降解，標(biāo)本保存、運(yùn)輸、解凍不當(dāng)?shù)榷寄軐?dǎo)致RNA破壞；②臨床診斷誤診，有類似臨床癥狀患兒被誤診為HFMD；③實(shí)時(shí)熒光PCR具有較高的特異度、靈敏度，易導(dǎo)致一定假陰性；④臨床標(biāo)本取材不當(dāng)、患者口腔表現(xiàn)不明顯、藥物影響等；⑤本次研究中部分重癥患者從其他醫(yī)院轉(zhuǎn)院而來，存在采集時(shí)間不當(dāng)，其中1例門診及入院時(shí)均采取咽拭子，門診采取標(biāo)本測(cè)定為CA16陽性，入院采集標(biāo)本腸道病毒為陰性；2例腸道病毒陰性患者，在其他實(shí)驗(yàn)室不同時(shí)間檢測(cè)到EV71，提示不同病程階段采集標(biāo)本可出現(xiàn)假陰性。咽拭子標(biāo)本進(jìn)行real time RT-PCR檢測(cè)存在一定假陰性，在臨床試驗(yàn)方面仍顯示了很好的可行性和有效性，在傳染病流行或暴發(fā)時(shí)，采集咽拭子進(jìn)行簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定的RT-PCR試驗(yàn)，對(duì)病原體的早期鑒定和分型具有重要意義，在控制疫情、應(yīng)對(duì)突發(fā)公共衛(wèi)生事件中發(fā)揮重要作用。

有關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)HFMD知識(shí)的宣傳教育，對(duì)易感人群（<5歲兒童），特別是幼托機(jī)構(gòu)、農(nóng)村居住者進(jìn)行HFMD相關(guān)知識(shí)教育，提高認(rèn)識(shí)，控制傳染源、切斷傳播途徑。廣大科研工作者應(yīng)加強(qiáng)病毒檢測(cè)和控制、基因組重組變異及疫苗、藥物的研究，有效控制疾病的發(fā)生、發(fā)展、暴發(fā)和流行，保護(hù)人類的健康。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 楊智宏，朱啟镕，李秀珠，等.2002年上海手足口病病例中腸道病毒71型和柯薩奇病毒A組16型的調(diào)查[J].中華兒科雜志，2005，43（3）：648-652.

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[8] Chang LY，Huang LM，Gau SS，et al.Neurodevelopment and cognition in children after enterovirus 71 infection[J].N Engl J Med，2007，356（12）：1226-1234.

[9] Hamaguchi T，F(xiàn)ujisawa H，Sakai K，et al.Acute encephalitis caused by intrafamilial transmission of enterovirus 71 in adult[J].Emerg Infet Dis，2008，14（5）：828-830.

[10] Chen CS，Yao YC，Lin SC，et al.Retrograde axonal transport：a major transmission route of enterovirus 71 in mice[J].J Virol，2007，81（17）：8996-9003.

[11] Wong KT，Munisamy B，Ong KC，et al.The distribution of inflammation and virus in human enterovirus 71 enceph alomyelitis suggests possible viral spread by neural pathways[J].J Neuropathol Exp Neurol，2008，67（2）：162-169.

（收稿日期：2013-09-27 本文編輯：袁 成）endprint

本研究提示，<3歲兒童占64.2%，<5歲兒童占87.2%，男性發(fā)病率高于女性。與文獻(xiàn)報(bào)道聊城地區(qū)HFMD主要集中在<5歲兒童接近，男女比例略有差異，這可能與病例選擇的地域范圍和時(shí)間段不同有關(guān)。而男性患病率高于女性，這與男孩活潑好動(dòng)，衛(wèi)生清潔意識(shí)較弱有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，HFMD患者農(nóng)村與城市比例為2.9∶1，且以<5歲農(nóng)村幼托兒童為主，這與農(nóng)村衛(wèi)生條件差及該年齡段兒童抵抗力弱、相互接觸密切、室內(nèi)通風(fēng)不良易發(fā)生交叉感染等因素有關(guān)。

本研究240例咽拭子中有170例腸道病毒陽性，陽性率為70.8%，另外有70份標(biāo)本腸道病毒陰性，分析其原因，主要有以下幾方面：①腸道病毒為RNA病毒，RNA在外界很容易被核酸酶降解，標(biāo)本保存、運(yùn)輸、解凍不當(dāng)?shù)榷寄軐?dǎo)致RNA破壞；②臨床診斷誤診，有類似臨床癥狀患兒被誤診為HFMD；③實(shí)時(shí)熒光PCR具有較高的特異度、靈敏度，易導(dǎo)致一定假陰性；④臨床標(biāo)本取材不當(dāng)、患者口腔表現(xiàn)不明顯、藥物影響等；⑤本次研究中部分重癥患者從其他醫(yī)院轉(zhuǎn)院而來，存在采集時(shí)間不當(dāng)，其中1例門診及入院時(shí)均采取咽拭子，門診采取標(biāo)本測(cè)定為CA16陽性，入院采集標(biāo)本腸道病毒為陰性；2例腸道病毒陰性患者，在其他實(shí)驗(yàn)室不同時(shí)間檢測(cè)到EV71，提示不同病程階段采集標(biāo)本可出現(xiàn)假陰性。咽拭子標(biāo)本進(jìn)行real time RT-PCR檢測(cè)存在一定假陰性，在臨床試驗(yàn)方面仍顯示了很好的可行性和有效性，在傳染病流行或暴發(fā)時(shí)，采集咽拭子進(jìn)行簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定的RT-PCR試驗(yàn)，對(duì)病原體的早期鑒定和分型具有重要意義，在控制疫情、應(yīng)對(duì)突發(fā)公共衛(wèi)生事件中發(fā)揮重要作用。

有關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)HFMD知識(shí)的宣傳教育，對(duì)易感人群（<5歲兒童），特別是幼托機(jī)構(gòu)、農(nóng)村居住者進(jìn)行HFMD相關(guān)知識(shí)教育，提高認(rèn)識(shí)，控制傳染源、切斷傳播途徑。廣大科研工作者應(yīng)加強(qiáng)病毒檢測(cè)和控制、基因組重組變異及疫苗、藥物的研究，有效控制疾病的發(fā)生、發(fā)展、暴發(fā)和流行，保護(hù)人類的健康。

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（收稿日期：2013-09-27 本文編輯：袁 成）endprint

本研究提示，<3歲兒童占64.2%，<5歲兒童占87.2%，男性發(fā)病率高于女性。與文獻(xiàn)報(bào)道聊城地區(qū)HFMD主要集中在<5歲兒童接近，男女比例略有差異，這可能與病例選擇的地域范圍和時(shí)間段不同有關(guān)。而男性患病率高于女性，這與男孩活潑好動(dòng)，衛(wèi)生清潔意識(shí)較弱有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，HFMD患者農(nóng)村與城市比例為2.9∶1，且以<5歲農(nóng)村幼托兒童為主，這與農(nóng)村衛(wèi)生條件差及該年齡段兒童抵抗力弱、相互接觸密切、室內(nèi)通風(fēng)不良易發(fā)生交叉感染等因素有關(guān)。

本研究240例咽拭子中有170例腸道病毒陽性，陽性率為70.8%，另外有70份標(biāo)本腸道病毒陰性，分析其原因，主要有以下幾方面：①腸道病毒為RNA病毒，RNA在外界很容易被核酸酶降解，標(biāo)本保存、運(yùn)輸、解凍不當(dāng)?shù)榷寄軐?dǎo)致RNA破壞；②臨床診斷誤診，有類似臨床癥狀患兒被誤診為HFMD；③實(shí)時(shí)熒光PCR具有較高的特異度、靈敏度，易導(dǎo)致一定假陰性；④臨床標(biāo)本取材不當(dāng)、患者口腔表現(xiàn)不明顯、藥物影響等；⑤本次研究中部分重癥患者從其他醫(yī)院轉(zhuǎn)院而來，存在采集時(shí)間不當(dāng)，其中1例門診及入院時(shí)均采取咽拭子，門診采取標(biāo)本測(cè)定為CA16陽性，入院采集標(biāo)本腸道病毒為陰性；2例腸道病毒陰性患者，在其他實(shí)驗(yàn)室不同時(shí)間檢測(cè)到EV71，提示不同病程階段采集標(biāo)本可出現(xiàn)假陰性。咽拭子標(biāo)本進(jìn)行real time RT-PCR檢測(cè)存在一定假陰性，在臨床試驗(yàn)方面仍顯示了很好的可行性和有效性，在傳染病流行或暴發(fā)時(shí)，采集咽拭子進(jìn)行簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定的RT-PCR試驗(yàn)，對(duì)病原體的早期鑒定和分型具有重要意義，在控制疫情、應(yīng)對(duì)突發(fā)公共衛(wèi)生事件中發(fā)揮重要作用。

有關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)HFMD知識(shí)的宣傳教育，對(duì)易感人群（<5歲兒童），特別是幼托機(jī)構(gòu)、農(nóng)村居住者進(jìn)行HFMD相關(guān)知識(shí)教育，提高認(rèn)識(shí)，控制傳染源、切斷傳播途徑。廣大科研工作者應(yīng)加強(qiáng)病毒檢測(cè)和控制、基因組重組變異及疫苗、藥物的研究，有效控制疾病的發(fā)生、發(fā)展、暴發(fā)和流行，保護(hù)人類的健康。

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