楊 勇，王占科，陳 鑫，鐘 瑩

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)標志物是HBV顆粒外殼蛋白成分誘導機體產生的抗體，結果異常并不意味著外周血存在HBV完整顆粒［1-4］。通過檢測HBV DNA可以了解HBV在體內存在的數量，HBV是否復制，乙型肝炎是否具有傳染性及傳染性有多強，是否有必要服藥，確定肝功能改變是否是由病毒引起，判斷適合用哪類抗病毒藥物及藥物治療的效果［5-8］。因此，HBV DNA定量檢測在臨床上意義重大。HBV標志物定性檢測與HBV DNA定量檢測的相關性研究，國內外已有報道［9-12］，但HBV標志物定量檢測與HBV DNA定量檢測的相關性研究，國內報道不多，為此，我們以大三陽和小三陽患者作為研究對象，同時檢測其HBV標志物定量結果和HBV DNA定量結果，并進行統(tǒng)計學分析和比較，旨在探討HBV標志物定量檢測和HBV DNA定量檢測在判斷HBV感染者傳染性中的臨床意義，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從2013年1月1日—2014年6月1日來我院檢驗科采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)確診的在感染性疾病科門診就診和住院的大三陽368例和小三陽507例中，各隨機選取50例作為大三陽組和小三陽組。大三陽組外周血HBV標志物HBsAg陽性、HBeAg陽性和HBcAb陽性，小三陽組組外周血HBsAg陽性、HBeAb陽性和HBcAb陽性。大三陽組男女性別比為 1:0．45，年齡(40．32±12.36)歲;小三陽組男女性別比為1:0．51，年齡(42．80±12．36)歲，大三陽組和小三陽組性別構成比、年齡之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，具有可比性。

1.2 材料與方法 大三陽組和小三陽組的血標本同時做HBV標志物定量和HBV DNA定量檢測。外周血HBV標志物定量檢測采用時間分辨熒光免疫測定法(TRFIA)測定，ELISA定性檢測HBV標志物試劑盒從北京萬泰生物技術有限公司購買，在上海普朗酶標儀上進行測定，實驗操作和結果判讀參考試劑盒操作說明書進行，陽性對照檢測結果陽性，陰性對照檢測結果陰性，室內質量控制在控。外周血HBV DNA定量檢測采用實時熒光定量PCR技術進行測定，試劑盒及實時熒光定量PCR擴增儀從廈門安普利生物技術有限公司購買，并保證室內質量控制結果在控，我院檢驗科基因擴增PCR實驗室通過省衛(wèi)生廳驗收合格。

1.3 結果判讀標準 HBV標志物定量檢測結果≥正常參考范圍上限為陽性，用實際數值表示;HBsAg結果超過240 ng/ml，需對檢測標本進行倍比稀釋后進行檢測，結果乘以稀釋倍數，檢測結果低于正常參考范圍下限為陰性。HBV DNA定量檢測結果用每毫升樣本的DNA拷貝數(copies/ml)表示，≤500為陰性。實時熒光定量PCR以起始HBV DNA標準品拷貝數的對數為橫坐標，以對應的Ct值為縱坐標，建立標準工作曲線，根據待測樣品的Ct值計算待測樣品的HBV DNA的拷貝數。

1.4 統(tǒng)計學分析 檢測到的陰性或陽性結果用百分率表示，采用卡方檢驗。檢測到的計量數據，先通過正態(tài)分布性檢驗，如果數據呈正態(tài)分布用均數±標準差(±s)表示，如果數據不呈正態(tài)分布需進行對數轉換后呈正態(tài)分布，再用均數±標準差(±s)表示，HBV DNA定量檢測結果數據需要進行對數轉換，采用t檢驗。相關性分析應用相關系數顯著性分析。α=0．05為檢驗水準。

2 結果

2.1 大三陽組和小三陽組HBV標志物定量和HBV DNA定量檢測結果分析 大三陽組定量檢測HBsAb和 HBeAb均為陰性;小三陽組定量檢測HbeAg均為陰性;大三陽組 HBsAg含量和 HBV DNA定量檢測結果均明顯高于小三陽組(P＜0.01)，HBcAb與小三陽組比較，無顯著性差異(P＞0．05)，見表1。

表1 2組乙型肝炎患者乙型肝炎病毒標志物和乙肝病毒DNA定量檢測結果比較(±s)

表1 2組乙型肝炎患者乙型肝炎病毒標志物和乙肝病毒DNA定量檢測結果比較(±s)

注:b P＜0.01

項目 單位 大三陽組(n=50)小三陽組(n=50)HBsAg ng/ml 165．23 ±86．14 42．18 ±16．77b HBsAb mIU/ml 陰性(＜10．0) 陰性(＜10．0)HBeAg PEIU/ml 26．56 ±12．14 陰性(＜0．5)HBeAb PEIU/ml 陰性(＜0．2) 3．02 ±0．81 HBcAb PEIU/ml 3．36 ±0．60 3．17 ±0．82 HBV DNA Lg(copies/ml) 7．32 ±1．30 4．35 ±2．11b

2.2 大三陽組和小三陽組HBV DNA定量陽性率比較 大三陽組HBV DNA定量陽性率為96．00%(48/50)，小三陽組陽性率為 16．00%(8/50)，二者差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

2.3 HBV DNA陽性的大三陽患者HBV DNA含量與HBeAg含量相關性研究 48例HBV DNA陽性的大三陽患者HBV DNA含量與HBsAg相關系數為0．6832，與 HBeAg 含量相關系數為 0．8563，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。

3 討論

HBV感染呈世界性流行，但不同地區(qū)HBV感染的流行強度差異很大，傳播途徑不確定［13-16］。據世界衛(wèi)生組織報道，全球約20億人曾感染過HBV，其中3．5億人為慢性HBV感染者，每年約有100萬人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原發(fā)性肝細胞癌［17-20］。HBV感染者部分發(fā)展成肝炎，部分為正常攜帶者，也有部分發(fā)展成肝硬化和肝癌［21-23］。HBV感染率高，不僅危害社會公共健康，也是醫(yī)務人員職業(yè)暴露時容易感染的病毒［24-25］，HBV感染者一部分人群為正常人群，無傳染性，也有部分人群具有傳染性，判斷HBV感染者是否具有傳染性，對做好HBV感染控制和預防工作，具有重要意義［26-29］。

HBV是一種具有嗜肝細胞生物學特征的雙鏈DNA病毒，為部分雙鏈環(huán)狀DNA。HBV含4個部分重疊的開放讀碼框(ORF)，即前S/S區(qū)、前C/C區(qū)、P區(qū)和X區(qū)。前S/S區(qū)編碼大(前S1、前S2及S)、中(前S2及S)、小(S)3種包膜蛋白;前C/C區(qū)編碼HBeAg及HBcAg;P區(qū)編碼聚合酶;X區(qū)編碼X蛋白。HBV基因組長度為3．2 kb，病毒完整顆粒為42 nm，包括病毒顆粒外殼和內核兩部分，1965年由Dane發(fā)現，又稱丹妮顆粒［30］。HBV主要存在于患者肝細胞內，如果HBV不復制或不活動，完整的病毒顆粒一般不會通過肝細胞膜釋放或分泌到肝細胞外，只分泌一些HBV外殼中的部分抗原物質，如HBV表面抗原等。肝臟是一個血供極其豐富的器官，一旦HBV從肝細胞內溢出，完整的含有病毒DNA的 HBV顆粒就存在于血液中［31］。外周血HBV存在3種形式，一是直徑為22 nm的球形顆粒，無傳染性，一般為 HBsAg蛋白;二是直徑為22 nm，長度為100 nm以上的管狀顆粒，也主要由HBsAg組成，不含核酸，無傳染性;三是大球形顆粒，也就是完整的HBV顆粒，直徑約42 nm，分為包膜和核心兩部分。包膜含HBsAg、HbeAg等抗原，核心含HBcAg抗原、環(huán)狀雙股HBV DNA和HBV DNA多聚酶，具有傳染性。因此，判斷HBV感染者是否具有傳染性主要取決于外周血有沒有完整的HBVDNA 和 HBeAg。

檢測HBV標志物的方法有很多，ELISA是檢測HBV標志物的經典方法，但只能定性，定量比較困難，不能確定患者血液中HBV相關抗原和抗體的含量，這對觀察HBsAg的含量變化、判斷臨床治療效果造成困難。TRFIA是一種繼放射免疫、酶免疫和發(fā)光免疫后的一種非放射性標記免疫分析技術。鑭系元素的螯合物為TRFIA所使用標記物，具有發(fā)出的熒光時間長、強度高等特點，因為大部分背景非特異熒光都是短暫存在的短時間熒光，鑭系金屬螯合物發(fā)出的熒光時間長，可有效地避免本底非特異熒光的干擾，故稱TRFIA［32］。TRFIA是一種定量檢測HBV標志物的新方法，具有靈敏度高、特異性好等特點［33］。本實驗表明:ELISA證實的大三陽和小三陽患者經TRFIA方法檢測均證實為大三陽和小三陽患者，提示HBV定量檢測和定性檢測結果一致。定性檢測向定量檢測發(fā)展是檢驗技術創(chuàng)新的方向，實時熒光定量PCR技術是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR技術為準確定量檢測外周血中HBV顆粒DNA水平，提供實驗工具［34］。

本研究結果表明:大三陽患者HBV表面抗原含量明顯高于小三陽患者，提示大三陽患者體內病毒含量較多，進一步研究證明，大三陽患者HBV DNA含量也明顯高于小三陽患者，為判斷大三陽患者具有較強的傳染性提供直接實驗室證據。同時，研究結果也表明:大三陽患者HBV DNA陽性率明顯高于小三陽患者，但并不是所有的小三陽患者HBV DNA都是陰性，也不是全部大三陽患者HBV DNA都是陽性，提示并不是全部小三陽患者都沒有傳染性，也不是全部大三陽患者都具有傳染性。判斷HBV感染者是否具備傳染性，必須結合PCR的方法檢測HBV DNA。當外周血存在完整的包裹DNA的病毒顆粒時，PCR才能檢測出陽性結果。HBV完整顆粒從肝細胞內分泌到外周血，是HBV正在復制的標記，HBV在復制過程中，高表達HBeAg到血液中，這可能是我們發(fā)現的HBV DNA含量和HBeAg明顯正相關，且相關系數大于其和HBsAg相關系數的原因。

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