王秀鳳,張 磊,伍慶華，閔建新，張 琰，羅來成△

(1．廣東藥學院基礎(chǔ)學院，廣州 510006； 2．江西中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，南昌 330006)

腎陽虛證與衰老以及諸多疾病關(guān)系密切，往往會導致機體發(fā)生廣泛的病理生理變化[1～5]，下丘腦-垂體-靶腺軸多個激素指標出現(xiàn)異常變化[6～8]，機體功能低下或紊亂。人們針對腎陽虛下丘腦-垂體-靶腺軸功能進行了大量的研究，但多數(shù)研究僅得到腎陽虛生物學指標的相關(guān)性初步結(jié)論[9～11]。為進一步揭示反映腎陽虛生物學指標之間的相互作用，從生物分子網(wǎng)絡(luò)的角度探討腎陽虛證發(fā)病機制，需要引進先進的數(shù)學分析方法。支持向量機(support vector machine, SVM)是Vapnik等提出的一種新的機器學習方法，由于其出色的學習性能，已成為當前的研究熱點。SVM最初應(yīng)用于分類問題，后來被推廣應(yīng)用到回歸問題中，形成了支持向量回歸機(support vector regression, SVR)理論。支持向量回歸機具有預(yù)測功能，因而可以利用支持向量回歸機建模預(yù)測輸入生物分子變化的時候輸出生物分子的變化，從而了解生物分子網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部的相互調(diào)控關(guān)系。由課題組前期建立的因子分析模型發(fā)現(xiàn)，腎陽虛時垂體-腎上腺軸與垂體-性腺軸的生物分子關(guān)系密切，且2個軸上的5個生物分子構(gòu)成因子分析模型的第一主成分[13]，即垂體-腎上腺軸與垂體-性腺軸的生物分子之間的調(diào)控關(guān)系是腎陽虛的主調(diào)控因子，提示垂體-腎上腺軸與垂體-性腺軸之間的調(diào)控失衡可能是腎陽虛發(fā)生的重要環(huán)節(jié)之一。因此，本文建立了腎陽虛大鼠垂體-腎上腺軸生物分子與垂體-性腺軸生物分子之間的支持向量回歸機模型，進一步探討腎陽虛過程中腎上腺與性腺功能的動態(tài)關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動物與飼料

SPF級Spague Dawla(SD)雄性大鼠，體質(zhì)量(200±20)g，由廣東省實驗動物中心提供(許可證號SCXK(粵)2008-0002)。基礎(chǔ)飼料由廣東省實驗動物中心提供。

1.2 藥物與試劑

0.9%氯化鈉注射液，藁城市四海藥業(yè)有限公司；氫化可的松注射液，山西晉新雙鶴藥業(yè)有限公司(國藥準字H14020980);黃體生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)、睪酮(T)、促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)和皮質(zhì)醇 (CORT)放射免疫試劑藥盒，Siemens Medical Solutions Diagnostics。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 SPF級雄性SD大鼠60只，購進后適應(yīng)環(huán)境5 d隨機分為正常對照組、腎陽虛模型組各30只。

1.3.2 動物造模及處理[7]

①正常組：0.9%的生理鹽水0.3 ml后肢肌肉注射，每日1次，自由飲水、飲食，連續(xù)29 d；②腎陽虛大鼠模型復(fù)制：氫化可的松混懸液充分混勻。按2.5 mg/100 g后肢肌肉注射，每日1次，自由飲水、飲食,連續(xù)29 d； ③處理：為獲得動態(tài)可靠的實驗數(shù)據(jù)，對動物采取平行處理，即2組動物分別在第15天(10只)、第23天(10只)、第30天(10只)處死，取血清用放射免疫分析法檢測ACTH、CORT、LH、FSH、T。

1.4 支持向量回歸機模型

2 結(jié)果

2.1 模型測試

本研究利用MATLAB2012軟件自編程序，建立了預(yù)測垂體-腎上腺軸與垂體-性腺軸動態(tài)變化規(guī)律的支持向量回歸機模型。首先對5個支持向量回歸機模型進行了留一法檢驗。對早、中、晚3個時期共30個樣本建立的支持向量回歸機模型，留一法檢驗是先把第1個樣本作為預(yù)測樣本，其余29個樣本作為訓練樣本，以此類推，每個模型總共得到30個預(yù)測誤差及30個預(yù)測復(fù)相關(guān)系數(shù)。結(jié)果30個預(yù)測誤差均小于10%，一定程度上說明模型的可行性。同時基于支持向量回歸機的腎陽虛生物分子網(wǎng)絡(luò)模型的30個復(fù)相關(guān)系數(shù)均大于0.96，亦說明此模型預(yù)測效果較好，可靠程度較高。

2.2 模型預(yù)測

根據(jù)支持向量回歸機模型留一法檢驗的復(fù)相關(guān)系數(shù)可知，這5個模型預(yù)測效果均較好，因此可以根據(jù)前3個模型預(yù)測腎陽虛早中晚3個時期垂體-腎上腺軸生物分子變化時，垂體-性腺軸生物分子的變化，從而得到腎陽虛時垂體-腎上腺軸對垂體-性腺軸的調(diào)控作用。同理，可以根據(jù)后2個模型預(yù)測腎陽虛早中晚3個時期垂體-性腺軸生物分子變化時，垂體-腎上腺軸生物分子的變化，從而得到腎陽虛時垂體-性腺軸生物分子對垂體-腎上腺軸生物分子的反饋作用。

表1 垂體-腎上腺軸生物分子變化時垂體-性腺軸生物分子的相對變化率(%)

表2 垂體-性腺軸生物分子變化時垂體-腎上腺軸生物分子的相對變化率

表1顯示，腎陽虛早期ACTH減小會使垂體-性腺軸3個生物分子增大，CORT減小使得垂體-性腺軸3個生物分子減小。垂體-腎上腺軸2個生物分子均減小使得性腺軸3個生物分子減小；而在腎陽虛中期，垂體-腎上腺軸2個生物分子減小均使得LH、FSH減小， T增大。并且垂體-腎上腺軸2個生物分子同時減小時，垂體-性腺軸生物分子變化率比2個生物分子單獨減小時大，兩者表現(xiàn)出協(xié)同作用；腎陽虛晚期垂體-性腺軸3個生物分子的變化規(guī)律性不強，且總體變化率相對較小。表2顯示，腎陽虛早期垂體-性腺軸生物分子逐一變化：LH減小時，垂體-腎上腺軸生物分子ACTH及CORT變化較大，其中ACTH增大，CORT減??；FSH及T各自減小時引起垂體-腎上腺軸生物分子的變化較??；FSH和T分別與LH同時減小以及LH、FSH和T 3個生物分子同時減小時均使得ACTH增大，CORT減小，說明LH與FSH、LH與T以及LH、FSH和T均有協(xié)同作用。腎陽虛中期，F(xiàn)SH、T逐漸發(fā)揮作用，但三者單一作用均不是很明顯，垂體-性腺軸3個生物分子兩兩減小及3個都減小時均使得垂體-腎上腺軸2個生物分子減小，亦顯示3個生物分子之間具有協(xié)同作用。腎陽虛晚期垂體-腎上腺軸2個生物分子相對變化率較小。

3 討論

表1、2顯示，腎陽虛晚期2個軸的5個生物分子變化率均相對較小，一方面可能與晚期造模時間過長、藥物毒性作用有關(guān)，同時也提示隨著腎陽虛程度的加重，生物分子之間的調(diào)控逐漸變?nèi)??？梢?，在腎陽虛的發(fā)生發(fā)展過程中，垂體-性腺軸生物分子與垂體-腎上腺軸生物分子之間的相互調(diào)控失衡是腎陽虛的發(fā)病機制之一。這符合以往對腎陽虛的研究結(jié)果[13，14]。同時本研究結(jié)果也提示，腎陽虛時垂體-靶腺軸的生物分子之間不是獨立的，它們相互關(guān)聯(lián)，具有復(fù)雜的交互作用，這符合人們近年來對生物機體功能網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系的新認識[15～17]。本研究從生物分子網(wǎng)絡(luò)角度，采用支持向量回歸機建模對腎陽虛大鼠垂體-腎上腺軸與垂體-性腺軸之間的非線性關(guān)系進行了動態(tài)分析，對揭示腎陽虛本質(zhì)及發(fā)生發(fā)展機制有一定的意義。同時證實，支持向量回歸機模型可以很好地擬合神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)中的非線性關(guān)系，如果納入更多的生物分子可以對腎陽虛有更全面清晰的認識。

[1] 龍泳伶,李政木. 金匱腎氣丸及其拆方對腎陽虛雌鼠卵巢功能的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2013，33(7)：967-971.

[2] 金蓉家,楊元宵,邢桂英,等. 腎氣丸對腎陽虛大鼠下丘腦-垂體-甲狀腺軸的調(diào)節(jié)作用初探[J].浙江中醫(yī)雜志,2013,48(5)：370-371.

[3] 趙敏，周安方，徐安莉,等. 右歸膠囊對腎陽虛大鼠免疫功能影響的實驗研究[J].湖北中醫(yī)藥大學學報,2013,15(1):18-20.

[4] 唐利華,沃興德,盧德趙,等. 溫補腎陽藥對激素依賴性腎陽虛動物肝線粒體蛋白質(zhì)組影響的研究[J]. 中國藥學雜志, 2007, 42 (3): 169-175.

[5] 劉希成,梁恒,田真,等. 腎陽虛證候的人血清比較蛋白質(zhì)組學分析[J]. 中國生物化學與分子生物學報, 2007, 23 (7) : 592-599.

[6] 歐陽軼強，鄒移海，張薇，等. 對大鼠甲狀腺他巴唑模型腎陽虛證動物模型下丘腦-垂體-靶腺軸幾項指標的考察[J]. 中醫(yī)藥學刊, 2006，24 (9) : 1658-1660.

[7] 王建紅，伍慶華，劉海云，等.腎陽虛大鼠垂體-甲狀腺軸功能動態(tài)分析[J].遼寧中醫(yī)雜志,2006，33(6)：751-752.

[8] 馬娜，王建紅，閔建新，等.腎陽虛大鼠垂體-靶腺軸功能動態(tài)變化的研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2009，20(9):2123-2125.

[9] 伍慶華，王建紅，劉海云,等.腎陽虛大鼠垂體- 甲狀腺軸與垂體- 性腺軸相關(guān)性研究[J]．江蘇中醫(yī)藥,2007，39(3):56-57.

[10] 閔建新，王建紅，伍慶華，等.腎陽虛大鼠垂體- 腎上腺皮質(zhì)軸與垂體- 性腺軸相關(guān)性研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2008，19(11):2576-2577.

[11] 王秀鳳，胡翊健，王建紅，等. 基于因子分析的正常、腎陽虛狀態(tài)大鼠垂體—靶腺軸激素相關(guān)性研究[J]．時珍國醫(yī)國藥，2011，22(4)：990-991.

[12] 閻平凡，張長水.人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)與模擬進化計算[M].北京：清華大學出版社，2005：161-163.

[13] 吳瑕，李東曉，鄧文龍.淫羊藿對生殖及內(nèi)分泌系統(tǒng)的藥理學研究進展[J].中國實驗方劑學雜志，2010,16(8):223-225.

[14] 包宇，楊建雄,孫潤廣.淫羊藿苷可緩解腎陽虛小鼠睪酮及性腺雄激素受體基因的表達下調(diào)[J].中國生物化學與生物分子學報，2011，27(2)：174-179.

[15] Stefan W, Almaas E. Peeling the yeast protein network [J].Proteomics, 2005，5 (2) : 444．

[16] 李梢. 中醫(yī)證候生物分子網(wǎng)絡(luò)標志的構(gòu)想與研究[J].中醫(yī)雜志，2009，50(9)：773-776.

[17] Li Shao Zhang Bo. Traditional Chinese medicine network pharmacology:theory, methodology and application[J]. Chinese Journal of Natural Medicines，2013，11(2)：110-120.