陳海娥，馬迎春，何金波，黃林靜，陳 丹，應(yīng) 磊，王萬鐵

（溫州醫(yī)科大學(xué)缺血-再灌注損傷研究所病理生理學(xué)教研室，浙江溫州325035）

肺缺血／再灌注損傷（lung ischemia reperfusion injury，LIRI）可在多種臨床情況下發(fā)生，包括心肺轉(zhuǎn)流，肺溶栓治療與肺移植等。近年來隨著心胸外科手術(shù)的廣泛開展，肺缺血／再灌注損傷的問題漸受重視。在再灌注早期進(jìn)行的一系列快速的血流中斷／再通的過程，其可以改變再灌注血流動力學(xué)并對缺血再灌注器官產(chǎn)生保護(hù)作用這叫做缺血后處理（ischemic postconditioning，IPO），是近年發(fā)現(xiàn)的一種重要內(nèi)源性保護(hù)機制。已有研究表明IPO對肺I／R有明顯的保護(hù)作用，但其機制仍不清楚［1］。

絲裂原活化蛋白激酶（motigen-activated protein kinases，MAPKs）家族是體內(nèi)一條重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，他們在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)代謝、基因表達(dá)、疾病、凋亡和外界刺激的應(yīng)答中有重要的作用。P38MAPK是其家族中重要的一個成員，目前已有很多實驗發(fā)現(xiàn)了其在心、肝、腦IPO中的重要作用［2-4］，但對于其在肺IPO中的作用還未探明，本研究旨在探討其在大鼠肺IPO中的作用，以期為臨床減輕肺缺血再灌注損傷提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

SB203580（貨號 S8307，美國 Sigma公司），原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（LOT：13033000，德國Roche公司），Trizol提取液（美國 Life technologies公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Fermentas Life Science公司），PCR試劑盒（美國Fermentas Life Science公司）；Bcl-2鼠多克隆抗體（美國santa cruz公司）；Bax鼠多克隆抗體（美國santa cruz公司）；即用型SABC過氧化物酶試劑盒（武漢博士德公司）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋生物科技有限公司），脫氧核糖核酸酶Ⅰ（美國Sigma公司），其余均為市售分析純。

1.2 實驗動物與分組

SPF級 SD大鼠40只，雄性，體重200～250 g。飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，由上海斯萊克動物實驗中心提供（實驗動物使用許可證號：SCXK（滬）2012-0002），動物實驗方案經(jīng)溫州醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會審核并同意實施。隨機將實驗動物分為5組（每組 8只）：對照組（C組），缺血／再灌注組（I／R組），缺血／再灌注組＋缺血后處理組（IPO組），缺血后處理＋0.4%DMSO的PBS溶液對照組（D組），缺血后處理 ＋SB203580組（SB組）。SB203580為P38MAPK的特異性抑制劑，用藥劑量為1 mg／kg體重，將 1 mg SB203580溶于7.5 ml 0.4%DMSO的PBS溶液中，使其充分溶解，根據(jù)文獻(xiàn)［5］可知SB203580發(fā)揮藥效的時間為注射后30～45 min，這樣我們只有在缺血30 min前尾靜脈注射入大鼠體內(nèi)才能保證在IPO時其已發(fā)揮對P38MAPK的抑制作用。各組實驗結(jié)束后留取左肺組織標(biāo)本。

1.3 動物模型復(fù)制

按照已發(fā)表文獻(xiàn)報道的方法復(fù)制大鼠原位肺缺血／再灌注和缺血后處理動物模型［1］。大鼠稱重后，按8 ml／kg體重20%烏拉坦腹腔注射麻醉。麻醉后氣管插管，連接小動物呼吸機，行機械通氣，呼吸機參數(shù)設(shè)置為：潮氣量 7～8 ml／kg，呼吸頻率 70 b／min，吸呼比3∶2。消毒左胸部皮膚，分離筋膜和肌肉，斷開第3、4根肋骨，打開胸腔，暴露左肺，游離左肺門，動脈夾夾閉30 min，即為缺血期，松開動脈夾，即為再灌注期，再灌注時間為2 h，如此即成功復(fù)制在體原位單肺缺血／再灌注模型；再灌注前給予連續(xù)的缺血30 s／再灌注30 s的處理共3次，結(jié)束后再灌注2 h，即為缺血后處理組。C組游離左肺門后不夾閉肺門，觀察 2.5 h。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 肺濕干重比（wet weight／dry weight，W／D）和總肺含水量（total lung water content，TLW）檢測 實驗結(jié)束后，處死動物并留取左肺約2 g組織，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸去多余水分后稱重，即為濕重（wet weight，W）；在 70℃恒溫烤箱內(nèi)烘烤 24 h，烘干后再稱重，直至重量不再變化，即為干重（dry weight，D），故肺組織濕／干重比（wet weight／dry weight，W／D）＝W÷D?？偡嗡浚╰otal lung water content，TLW）的計算公式如下：TLW＝（W-D）÷D。

1.4.2 肺組織光鏡檢測及肺泡損傷數(shù)定量評價指標(biāo)（index of quantitave assessment，IQA）檢測 各組實驗結(jié)束后，處死動物，取左肺下葉約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小肺組織，生理鹽水沖洗干凈，浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)行石蠟包埋，切片，HE法染色，于普通光學(xué)顯微鏡下觀察各組標(biāo)本組織形態(tài)學(xué)改變。在200倍視野下隨機連續(xù)觀察50個視野，計數(shù)每個視野下的總肺泡數(shù)及損傷肺泡數(shù)。肺泡內(nèi)含紅細(xì)胞和或白細(xì)胞超過2個以上或肺泡內(nèi)含有水腫滲出液的均視為損傷肺泡。把損傷肺泡數(shù)占總計肺泡數(shù)百分比的值作為IQA（%）。

1.4.3 原位末端標(biāo)記（TUNEL）法檢測 依據(jù)Roche公司提供的試劑盒說明書所述方法進(jìn)行操作。凋亡細(xì)胞胞核經(jīng)DAB染色呈棕褐色，未凋亡細(xì)胞胞核復(fù)染后呈藍(lán)紫色。計數(shù)5個高倍鏡（×400）下的凋亡細(xì)胞數(shù)。每張片子至少觀察500個細(xì)胞，計算每100個細(xì)胞內(nèi)的陽性細(xì)胞，即凋亡指數(shù)（apoptotic index，AI）。

1.4.4 RT-PCR法測定肺組織 Bax、Bcl-2基因的表達(dá) Trizol法提取肺組織總RNA。測定總RNA濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。再按照PCR試劑盒說明書進(jìn)行cDNA擴增。內(nèi)參及各目的基因的序列如下表1。PCR反應(yīng)條件為：起始變性，94℃，3 min；變性，94℃，30 s；退火，55℃（βactin和 Bax）／61.6℃（Bcl-2），30 s；延伸，72℃，1 min；終止延伸，72℃，5 min。循環(huán)數(shù)β-actin和Bax 30次，Bcl-2 33次。各目的基因擴增產(chǎn)物片段長度為：βactin：378 bp；Bax：337 bp；Bcl-2：411 bp。用各基因擴增產(chǎn)物的密度與β-actin基因擴增產(chǎn)物的密度比值表示各基因表達(dá)水平。

Tab.1Sequences of the primers

1.4.5 免疫組化法檢測標(biāo)本中Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平及其定位 按照試劑盒所提供的說明書和文獻(xiàn)［6］所述步驟進(jìn)行操作。標(biāo)本上呈棕褐色的部分為Bcl-2、Bax蛋白陽性表達(dá)。采用美國 IPP6.0（Image-pro plus）彩色圖像分析系統(tǒng)測定陽性部位及背景的光密度值，以陽性部位的光密度值減背景的光密度值代表陽性部位的吸光度（optical density，OD）值。

1.4.6 統(tǒng)計學(xué)處理 計量資料均進(jìn)行正態(tài)性檢驗，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，采用 SPSS 17.0軟件，多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊性者兩兩比較采用LSD法，方差不齊者進(jìn)行Dunnet’s t檢驗。雙變量相關(guān)性分析，采用Bivariate過程的Pearson相關(guān)分析法。

2 結(jié)果

2.1 肺組織濕／干重比 （W／D）和總肺含水量（TLW）的變化

與C組相比，I／R組 W／D和 TLW均明顯升高（P＜0.01），IPO組、D組、SB組與 I／R組相比，W／D和TLW均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），IPO組與D組相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），SB組與 IPO組相比，W／D和 TLW均明顯降低（P＜0.01，表 2）。

Tab.2 W／D、TLW、IQA、AI in lung tissues of different groups（ˉx±s，n＝8）

2.2 光鏡下肺組織形態(tài)學(xué)的變化及肺泡損傷數(shù)定量評估（IQA）

與 C組相比，I／R組 IQA顯著升高（P＜0.01）；IPO組、D組、SB組與 I／R組相比，IQA顯著降低（P＜0.01）；IPO組與D組相比，IQA差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；SB組與 IPO組相比，IQA顯著降低（P＜0.01，表2）。光鏡下，C組肺間質(zhì)及肺泡結(jié)構(gòu)保持完整，無受損，未見炎性細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤；I／R組可見肺間質(zhì)增寬水腫，炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡內(nèi)可見較多紅細(xì)胞滲出，偶可見肺部實性變，損傷明顯；IPO組與D組肺泡損傷較I／R組稍減輕，視野下可見完整肺泡，炎性細(xì)胞及紅細(xì)胞浸潤量少；SB組肺泡結(jié)構(gòu)相對完整，肺泡間質(zhì)水腫不明顯，少量紅細(xì)胞及炎性細(xì)胞浸潤（圖1）。

Fig.1 Structure of the left lung in each group under microscope（HE×200）

2.3 各組細(xì)胞凋亡情況及AI值的變化

與 C組相比，I／R組凋亡指數(shù)（35.650±0.762）顯著升高，D組（25.738±0.944）、SB組（20.850±0.961）、IPO組 AI（26.263±0.952）顯著低于 I／R組（均 P＜0.01），D組與 IPO組相比無明顯差異（P＞0.05），SB組顯著低于 IPO組（P＜0.01，表2）。凋亡細(xì)胞主要為肺泡上皮細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞（圖2）。

Fig.2 Apoptotic cells in lung tissue of each group（DAB×400）A：Cgroup（control group）；B：I／R group（ischemia／reperfusion group）；C：IPOgroup（ischemic postconditioning group）；D：D group（dimethyl sulfoxide group）； E： SB group（SB203580 group）

2.4 肺組織Bax、Bcl-2基因表達(dá)水平的變化

在C組Bcl-2呈高水平表達(dá)、Bax表達(dá)不明顯，I／R組較C組Bcl-2表達(dá)明顯下降、Bax明顯上調(diào)，同時 Bcl-2／Bax的比值降低（P均 ＜0.01）；與 I／R組比較，D組、SB組、IPO組 Bcl-2 mRNA表達(dá)增強，Bax mRNA表達(dá)減弱，Bcl-2／Bax的比值增高（均 P＜0.01），D組與 IPO組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；SB組 IPO組比較，Bcl-2表達(dá)上調(diào)、Bax表達(dá)下降，二者比值升高（P＜0.05，P＜0.01，表 3、圖3）。

Tab.3 Relative amout of Bcl-2、Bax mRNA and ratio of Bcl-2／Bax mRNA in lung tissue in each group（ˉx±s，n＝8）

Fig.3 RT-PCR electrophoresis strip of Bcl-2 and Bax in lung tissue of each group

2.5 肺組織 Bax、Bcl-2蛋白的表達(dá)水平的變化及定位

在C組Bcl-2呈高水平表達(dá)、Bax表達(dá)不明顯，I／R組表達(dá)較C組Bcl-2表達(dá)明顯下降、Bax明顯上調(diào)，同時 Bcl-2／Bax的比值降低（均 P＜0.01）；與 I／R組比較，D組、SB組、IPO組Bcl-2蛋白表達(dá)增強，Bax表達(dá)減弱，Bcl-2／Bax的比值增高（均 P＜0.01）；D組IPO組相比無明顯差異（P＞0.05）；SB組Bcl-2表達(dá)較IPO組明顯增高、Bax表達(dá)明顯降低，二者比值增高（均 P＜0.01，表 4），Bcl-2、Bax蛋白陽性表達(dá)部位主要是支氣管上皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿（圖4、圖5）。

Tab.4 Optical density of Bcl-2、Bax of lung tissues in different groups and ratio of Bcl-2／Bax protein（ˉx±s，n＝8）

Fig.4 Expression of Bcl-2 protein in lung tissue of each group（immunohistochemistry DAB×200）

Fig.5 Expression of Bax protein in lung tissue of each group（immunohistochemistry DAB×200）

2.6 相關(guān)性分析

肺組織 AI與肺組織 W／D、TLW、IQA、Bax基因及蛋白表達(dá)之間呈正相關(guān)（r分別為0.870，0.870，0.953，0.908，0.963，均 P＜0.01，n＝40）；肺組織 AI與肺組織Bcl-2基因及蛋白、Bcl-2／Bax基因及蛋白呈負(fù)相關(guān)（r分別為-0.858，-0.922，-0.941，-0.980，P均 ＜0.01，n＝40）。

3 討論

自從2003年Zhao等［7］成功的在犬心肌梗死模型上證實IPO可明顯縮小心肌梗死面積并且其保護(hù)作用與預(yù)處理相當(dāng)之后，許多國內(nèi)外學(xué)者對IPO進(jìn)行了一系列從其是否有保護(hù)作用到其作用機制的研究，并逐步證實IPO在多種實驗動物的心、肝、腦等器官具有保護(hù)作用［2-4］。目前其保護(hù)機制還不十分清楚。本實驗通過測量肺組織損傷程度的敏感指標(biāo)W／D、TLW、IQA顯示，IPO成功的減輕了肺 I／R所造成的肺組織損傷；而AI值則是細(xì)胞凋亡的指標(biāo)，其在各個組的變化表明，IPO能減輕肺細(xì)胞凋亡，根據(jù)相關(guān)性分析得知AI與W／D、TLW、IQA呈顯著正相關(guān)，這表明細(xì)胞凋亡參與肺I／R損傷的發(fā)生。許多研究表明Bcl-2基因家族參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控，其調(diào)控機制主要是由于Bcl-2／Bax基因的相互作用，其中Bcl-2的作用是抑制細(xì)胞凋亡，Bax的作用是促進(jìn)細(xì)胞凋亡，細(xì)胞存亡與否由二者之比所決定，Bcl-2占優(yōu)勢時細(xì)胞存活，Bax占優(yōu)勢時細(xì)胞走向凋亡［8］。本研究通過檢測各組Bcl-2、Bax基因及蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步證實各組中細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果證實IPO上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax基因和蛋白，從而減輕細(xì)胞凋亡。

p38MAPK是1993年發(fā)現(xiàn)的MAPK家族的又一重要成員 p38MAPK可被應(yīng)激刺激、腫瘤壞死因子a、白細(xì)胞介素1、成纖維細(xì)胞生長因子、脂多糖和革蘭氏陽性細(xì)菌細(xì)胞壁成分激活［9］。因此，又稱為MAPK應(yīng)激信號通路。本實驗室已通過實驗證明p38MAPK在肺I／R中被激活而使肺組織損傷和肺細(xì)胞凋亡加重［6］。很多實驗也證實其在IPO中具有重要作用，但其在各個器官中所起的作用并不完全一致，這可能和其在各個器官中的亞型不同有關(guān)。

本文主要是通過應(yīng)用P38MAPK的抑制劑SB203580來說明其在IPO中的作用，這是基于本實驗室以前的已經(jīng)證明P38MAPK在I／R中的作用這一結(jié)果上來開展的，本室先前的實驗通過I／R時應(yīng)用SB203580證實：I／R時可以通過應(yīng)用SB203580來抑制P38MAPK從而產(chǎn)生保護(hù)作用，也就是說I／R很可能是通過激活P38MAPK來對缺血器官造成損傷的［6］?；谶@一事實，我們繼續(xù)應(yīng)用SB203580這一P38MAPK的特異性抑制劑來干預(yù)IPO，來證明IPO是通過抑制P38MAPK對I／R器官產(chǎn)生保護(hù)作用的。從實驗結(jié)果來看，應(yīng)用SB203580之后肺IPO減輕肺組織損傷和細(xì)胞凋亡的作用更加明顯，這說明可能是通過抑制p38MAPK的活化來產(chǎn)生對肺I／R損傷的保護(hù)作用的。并且已有文獻(xiàn)表明，p38MAPK激活可以使抑制凋亡蛋白Bcl-2發(fā)生磷酸化改變，使線粒體釋放細(xì)胞色素C而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［10］。再結(jié)合本實驗結(jié)果，表明在肺I／R中IPO可能抑制p38MAPK激活，減少Bcl-2磷酸化改變，以此來減輕肺組織損傷和肺細(xì)胞凋亡。

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