陳 倩，韓 齊，孔保華，夏秀芳，劉 騫

乳酸菌對發(fā)酵肉制品中肌肉蛋白降解作用的研究進展

陳 倩，韓 齊，孔保華*，夏秀芳，劉 騫

（東北農(nóng)業(yè)大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

乳酸菌是發(fā)酵肉制品中常見的微生物之一，其對肌肉蛋白的降解作用是發(fā)酵肉制品風味形成及品質改善的關鍵因素。本文簡述與肌肉蛋白水解作用相關的微生物酶類及其對品質特性的影響，綜述在不同模擬體系——體外模擬體系和發(fā)酵肉制品體系中乳酸菌對肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的降解作用，并提出現(xiàn)行研究中存在的問題和發(fā)展方向，這些對于功能性肉制品發(fā)酵劑的開發(fā)具有參考價值。

乳酸菌；發(fā)酵肉制品；肌肉蛋白；微生物酶；降解作用

乳酸菌是發(fā)酵肉制品中最常用的微生物之一，包括乳桿菌屬、片球菌屬和鏈球菌屬（表1）。在肉制品發(fā)酵和成熟過程中，其可利用碳水化合物產(chǎn)酸，降低肉品pH值，進而抑制致病菌和腐敗菌的生長[2-3]；使肌肉蛋白變性，改善肉制品的組織結構[4]；利于NO2－分解成NO，促進肉制品發(fā)色，有利于提高腌肉色澤的穩(wěn)定性[5]。此外，乳酸菌可通過對游離氨基酸的釋放與降解來調節(jié)揮發(fā)性與非揮發(fā)性化合物的組成，進而影響發(fā)酵肉制品風味的形成[6]。而對于大多數(shù)的非揮發(fā)性化合物，如多肽和氨基酸，是由蛋白質水解產(chǎn)生的，因此，蛋白質水解作用對發(fā)酵肉制品風味的形成至關重要。

表1 發(fā)酵肉制品中常見的乳酸菌[11]Table 1 Lactic acid bacteria in fermented meats[11]

1 與蛋白質降解相關的酶類

在發(fā)酵肉制品成熟過程中，蛋白質的降解是一個重要的反應過程。肌肉蛋白降解是肌肉內(nèi)源酶和微生物蛋白酶共同作用的結果，發(fā)酵初期在內(nèi)源酶（主要是組織蛋白酶）的作用下肌肉蛋白被分解成多肽，然后再由內(nèi)源性氨肽酶以及微生物酶（如肽鏈端解酶）作用將多肽降解為小肽和游離氨基酸，其中許多氨基酸是風味物質，或者作為風味物質的前體物質，再通過微生物轉氨、脫氨以及脫羧作用生成醛、酸、醇和酯等芳香化合物[7-9]。然而，與蛋白質降解相關的酶系非常復雜，目前尚不能完全確定它們在整個發(fā)酵和成熟過程中的專一性及反應歷程。

表2 清酒乳桿菌中與肌肉蛋白質降解相關的酶類[10-14]Table 2 Purified enzymes of Lactobacillus ssaakkee involved in degradation of meat proteins[10-14]

近年來，很多學者研究了乳酸菌蛋白水解酶系統(tǒng)的復雜性與多樣性。利用離子交換色譜以及凝膠過濾等提純技術分離純化并鑒定了與肌肉蛋白降解相關的酶類，基本上是清酒乳桿菌產(chǎn)生的（表2）[10-14]。通常，這些肽鏈端解酶可增加游離氨基酸含量，促進風味的形成。

乳酸菌對蛋白質的降解作用主要是這些酶系共同作用的結果。首先，肌肉蛋白在乳酸菌胞外蛋白酶和肌肉內(nèi)源酶的共同作用下生成多肽，其中生成的小肽（分子質量小于3 000 D）與風味形成有關[15]。盡管不能完全通過多肽的親水疏水性來判斷它對風味形成的貢獻，但研究表明，親水性肽更容易產(chǎn)生鮮味和甜味，促進發(fā)酵風味的形成[16]。隨后，乳酸菌的各種肽酶降解多肽生成游離氨基酸，這是乳酸菌作用形成風味的主要途徑。除了乳桿菌外，片球菌也可增加游離氨基酸含量，但同一菌屬、不同菌株以及在不同體系中所表現(xiàn)的的活力不盡相同，這主要受實驗條件的影響，比如pH值、濕度以及氯化鈉含量等因素。游離氨基酸可作為風味物質或者風味物質的前體物質進一步參與風味的形成[17]。其中，谷氨酰胺代謝產(chǎn)生的谷氨酸在發(fā)酵后期會大量積累，它能夠產(chǎn)生鮮味；此外，一些支鏈氨基酸也會有所增加，這些氨基酸可以在轉氨酶的作用下進一步代謝生成α-酮酸，它是可以產(chǎn)生麥芽味的醛類，果香味的醇類以及其他發(fā)酵風味物質的前體化合物[18]?？傊?，乳酸菌對蛋白質的降解以及風味形成的作用值得我們探究。

2 乳酸菌對蛋白質降解作用

為了闡述肉制品在發(fā)酵過程中乳酸菌對蛋白質的降解作用，采取了不同的模擬體系。一種是排除肌肉內(nèi)源性蛋白酶作用，單獨考察乳酸菌對肌肉蛋白質的降解能力。通常是建立一個體外模擬體系，即向液體培養(yǎng)基中添加肌肉蛋白提取物，還有少數(shù)的研究在發(fā)酵肉制品中添加抑菌劑以及肌肉蛋白酶抑制劑，考察乳酸菌對兩種蛋白的降解情況。在這種體外模擬體系中，測定乳酸菌對肌肉蛋白提取物的水解作用，更具有針對性；另一種是發(fā)酵肉制品體系，在有內(nèi)源酶存在的條件下研究乳酸菌對肌肉蛋白的降解情況，這種方法更能真實地反映發(fā)酵肉制品中乳酸菌對肌肉蛋白降解的能力，同時也適合肉制品發(fā)酵劑的篩選。

2.1 體外模擬體系

在早期研究中，這種模擬體系就是含有一定濃度肌肉蛋白提取物的溶液，隨后將其改良，在培養(yǎng)基中添加一定量的肌肉蛋白提取物。在提取肌肉蛋白的過程中，肌肉內(nèi)源性蛋白酶遭到破壞失去活性，因此這種體系幾乎可完全排除肌肉內(nèi)源性蛋白酶的影響，同時模擬乳酸菌在肉基質中生長的條件，利于分析僅由乳酸菌作用引起的肌漿蛋白和肌原纖維蛋白降解。研究多集中在考察乳桿菌的全細胞懸浮液（whole cell suspension，WCS）、無細胞提取物（cell-free extract，CFE）以及兩者的等比例混合物對豬肉肌漿蛋白以及肌原纖維蛋白提取物分解能力，其中CFE作為酶的一個來源。

Fadda等[19]采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳和反相高效液相色譜研究了植物乳桿菌CRL681對肌漿蛋白和肌原纖維蛋白在0 d和4 d的降解情況。不接菌的肌漿蛋白在0 d和4 d的電泳條帶基本一致，說明在肌漿蛋白提取過程中大部分內(nèi)源酶被破壞（圖1a）；而不接菌的肌原纖維蛋白第4天的電泳條帶發(fā)生了現(xiàn)在的降解，這可能是其中殘留的內(nèi)源酶作用的結果（圖1b）。從結果可看出，該株乳酸菌對肌肉蛋白有一定的水解作用，并且對肌漿蛋白的水解作用較強（圖1a），添加WCS后，97、45、37、26 kD處的條帶發(fā)生了不同程度的降解，同時發(fā)現(xiàn)添加CFE可促進肌漿蛋白的水解。從圖1b可知，該株乳酸菌對肌原纖維蛋白的水解作用不大，添加WCS后200 kD和45 kD處的條帶發(fā)生了輕微的降解，產(chǎn)生了新的條帶，但是添加CFE對肌原纖維蛋白降解沒有顯著的促進作用，這說明肌肉蛋白質可能不適合作為CFE表現(xiàn)其胞內(nèi)酶活性的底物，而且植物乳桿菌CRL681 CFE中可能沒有水解肌肉蛋白提取物的蛋白酶；另外，可初步推斷水解肌肉蛋白提取物的蛋白酶活性是同此菌體細胞的細胞壁相連的，并存在于活的全細胞中[20-21]。此外，從經(jīng)過乳酸菌作用后的條帶復雜程度說明肌原纖維蛋白不容易被乳酸菌降解。

圖1 植物乳桿菌對肌漿蛋白（a）和肌原纖維蛋白（b）提取物的降解[19]Fig.1 SDS-PAGE of hydrolysis of sarcoplasmic protein (a) and myofibrillar protein (b) by Lactobacillus plantarum[19]

此外，他們還詳細分析了其蛋白水解產(chǎn)物如多肽、氨基酸的類型及產(chǎn)生這些物質的前體和原因。結果表明在WCS或WCS和CFE共同作用下，肌原纖維蛋白和肌漿蛋白降解生成的多肽性質不盡相同。肌原纖維蛋白和肌漿蛋白在全細胞的作用下都會生成親水性多肽，這種親水性多肽利于形成良好的腌肉風味；而添加無細胞提取物后一些疏水性多肽含量會增加，這表明外源酶的加入或者多肽酶的過表達可能是風味化合物產(chǎn)生的關鍵。Visessanguan等[22]也同意該觀點，纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和賴氨酸可能是由肌肉蛋白水解作用產(chǎn)生的，它們在后期的成熟過程中占主導，這對發(fā)酵肉制品風味的形成有一定貢獻。

其他報道[23-27]也利用同樣的方法研究了干酪乳桿菌CRL705、彎曲乳桿菌CECT904、清酒乳桿菌CECT4808、植物乳桿菌CRL 681和植物乳桿菌6003對肌肉蛋白質的水解作用，結果表明這些菌株對肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的降解有潛在的作用；隨后，Pereira等[28]的研究證明彎曲乳桿菌和同型腐酒乳桿菌兩株乳桿菌有胞外蛋白水解酶活性，并且菌株在對數(shù)生長期表現(xiàn)出最大的蛋白水解活性。

實際上，在發(fā)酵過程中蛋白質水解除了與乳酸菌酶類水解活力有關外，還與乳酸菌產(chǎn)酸代謝相關。Saunders等[29]研究表明pH值低于4.5利于肌原纖維蛋白的降解，并且在pH 3.0時降解程度達到最大。Fadda等[30]采用不同pH 4.0和pH 6.0的發(fā)酵體系，研究經(jīng)植物乳桿菌CRL681在30 ℃發(fā)酵96 h后肌漿蛋白的降解情況。結果表明，在這兩個pH值下，菌株能夠在可溶性肌肉蛋白中生長并且對其有降解能力。實驗發(fā)現(xiàn)在pH 4.0條件下植物乳桿菌對肌漿蛋白的降解能力很強，并且在發(fā)酵香腸體系中也有同樣的結果，這是肉源性酸性蛋白酶、菌株蛋白水解活力以及乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸等方面協(xié)同作用的效果；在pH 6.0條件下蛋白質發(fā)生輕微的水解，這可能是乳酸菌蛋白酶水解的作用（圖2）。

圖2 植物乳桿菌在pH 4.0（a）和pH 6.0（b）下對肌漿蛋白提取物的降解[30]Fig.2 SDS-PAGE of sarcoplasmic protein hydrolysis by Lactobacillus plantarum incubated at controlled pH 4.0 (a) and pH 6.0 (b) for 96 h at 30 ℃[30]

Fadda等[31]選擇了改良的模擬體系，在培養(yǎng)基中補充添加肌肉蛋白提取物，考察從發(fā)酵香腸分離出的清酒乳桿菌對肌肉蛋白的降解能力。結果表明，合成培養(yǎng)基（CDM）在0 h和72 h時，電泳圖中均未出現(xiàn)條帶（圖3，泳道1、2），而接種清酒乳桿菌的CDM電泳圖中有極其微弱的條帶（泳道3）產(chǎn)生，這可能是菌體蛋白產(chǎn)生的；添加肌漿蛋白和肌原纖維蛋白提取物的CDM（S-CDM和M-CDM）在0 h和72 h時分別出現(xiàn)了相應的蛋白條帶（泳道4、5、8、9）。S-CDM和M-CDM經(jīng)30 ℃處理72 h后與0 h相比，電泳圖存在差別： S-CDM條帶未發(fā)生顯著變化（泳道5），而M-CDM在42～134kD范圍內(nèi)條帶數(shù)增加（泳道9），這可能是肌原纖維蛋白在提取過程中殘余的內(nèi)源酶作用所致；然后在S-CDM和M-CDM中接種清酒乳桿菌發(fā)酵72 h，肌漿蛋白發(fā)生降解，產(chǎn)生了67 kD和22 kD兩個條帶（泳道6），而肌原纖維蛋白降解產(chǎn)生了較多新的條帶（泳道10）。這些新條帶的產(chǎn)生一方面是內(nèi)源酶和清酒乳桿菌共同作用的結果；另一方面，可能是菌體細胞裂解產(chǎn)生了一些菌體蛋白所致。

圖3 接種和未接種清酒乳桿菌對補充添加以及未補充添加肌漿蛋白和肌原纖維蛋白提取物的培養(yǎng)基電泳圖[31]Fig.3 SDS-PAGE of CDM supernatants (C, S-CDM and C-CDM) inoculated with or without L.sakei 23K[31]

2.2 發(fā)酵肉制品體系

Verplaetse等[32]在香腸加工過程中加入微生物抑制劑以及蛋白酶抑制劑，結果發(fā)現(xiàn)，添加蛋白酶抑制劑的肌動蛋白和肌球蛋白的降解程度要比添加微生物抑制劑的小。這表明內(nèi)源性蛋白酶在蛋白質降解過程中比微生物分泌的蛋白酶發(fā)揮的作用要大，特別是在加工過程的初期。盡管如此，在成熟后期細菌蛋白水解活力對肌肉蛋白的降解作用還是很大的，它可以降解多肽生成大量的小肽和氨基酸，這些多肽和氨基酸是風味化合物以及一些風味化合物的前體物質，促進成熟過程[33]。在發(fā)酵肉制品體系中研究乳酸菌對肌肉蛋白質的降解作用更具有實踐意義，在發(fā)酵劑的篩選以及發(fā)酵工藝優(yōu)化等方面具有指導作用。

Villani等[34]分析了傳統(tǒng)意大利發(fā)酵香腸在發(fā)酵和成熟過程中的菌相變化，并且分離鑒定出在此過程中的優(yōu)勢菌株，其中主要的乳酸菌有彎曲乳桿菌BVL7、清酒乳桿菌BVL6和清酒乳桿菌BVL26，然后再將其作為發(fā)酵劑添加到香腸中發(fā)酵14 d，考察它們對肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的降解情況。電泳結果如圖4所示，在內(nèi)源酶和微生物酶兩種酶水解體系的作用下，14～45 kD區(qū)域內(nèi)的蛋白條帶發(fā)生了變化，肌漿蛋白中的肌紅蛋白（14 kD）降解的最為嚴重，另外接種彎曲乳桿菌BVL7和清酒乳桿菌BVL的43 kD處對應的條帶也降解消失了，這是1種重要的骨骼肌酶——肌酸激酶，34 kD處的條帶也有輕微的降解（圖4a）。這3 種乳酸菌對肌原纖維蛋白的降解作用遠不如對肌漿蛋白的明顯（圖4b），降解的部分主要是集中在14～75 kD區(qū)域內(nèi)，只是發(fā)生了輕微的變化。25、20 kD這兩個條帶分別對應肌球蛋白輕鏈-1和輕鏈-2，與對照組相比，這兩個條帶強度稍微減弱了。

圖4 乳桿菌對發(fā)酵香腸中肌漿蛋白（a）和肌原纖維蛋白（b）的降解[34]Fig.4 Hydrolysis profiles of sarcoplasmic protein (a) and myofibrillar protein (b) of Italian fermented sausages with different Lactobacillus strains[34]

Fadda等[35]選擇了市場上常見的10種阿根廷干發(fā)酵腸，通過SDS-PAGE和低分子質量多肽的分離鑒定來評價肌肉蛋白的水解作用。SDS-PAGE結果亦表明在內(nèi)源酶和乳酸菌作用下，肌漿蛋白和肌原纖維蛋白發(fā)生了水解，并且肌漿蛋白的水解程度較大。其中有一種產(chǎn)品的蛋白水解較強烈，這可能與其發(fā)酵技術有關，如發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間[36]。接下來通過考察感官特性、理化特性（pH值和水分活度）以及安全性（腐敗菌和致病菌），從這10 種香腸中篩選出了5 種。將香腸的蛋白提取物進行超濾，得到分子質量低于3 000 D的多肽，這些與風味有關的多肽就分離出來了。分子質量大于3 000 D的部分經(jīng)過反向高效液相色譜進行分析，收集那些發(fā)生改變的峰，用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF/MS）儀對這部分碎片進行質譜分析。結果表明，在發(fā)酵和成熟過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白降解生成了低分子質量的多肽（1 000～2 100 D），經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)其氨基酸組成很復雜，由親水性和疏水性氨基酸組成。從多肽的斷裂點可推斷出其在親緣蛋白質上的位置，斷裂點的位置反映出水解體系的復雜性，肌漿蛋白發(fā)生水解的位點較肌原纖維蛋白的要多。肌動蛋白水解得到了4 種多肽，它們對應著蛋白質N端及其中心區(qū)域，而肌球蛋白水解得到了3 種多肽，只源于N端區(qū)域。這些結果也說明了在發(fā)酵肉制品中肌原纖維蛋白降解的作用較肌漿蛋白的要弱。

3 乳酸菌對蛋白質降解作用研究存在的問題

肌肉蛋白水解作用是發(fā)酵肉制品特殊風味形成的一個重要途徑。作為應用最為廣泛的肉品發(fā)酵劑之一，乳酸菌對肌肉降解作用得到了廣泛的研究，但是關于乳酸菌酶系對肌肉蛋白降解作用的機制和歷程以及一些發(fā)酵工藝對乳酸菌水解蛋白質的影響等問題尚待闡明。

3.1 研究中存在的問題及發(fā)展趨勢

目前，多數(shù)研究集中在模擬體系中考察乳酸菌是否對不同的肌肉蛋白具有降解作用以及降解的程度，進而對分離出的低分子肽進行鑒定，并分析其性質，但是關于肌肉蛋白在降解過程中乳酸菌酶系的作用機制研究較少，肌肉內(nèi)源酶與微生物酶系怎樣調節(jié)蛋白降解以及這些酶的專一性等問題仍需探究。另外，乳酸菌之間可能因菌株個體差異性使得其對蛋白質水解作用機制不同，例如，肉源性乳桿菌的胞外蛋白酶活力遠不如乳源性乳桿菌的強，肉源性清酒乳桿菌32K的基因組沒有編碼外源性蛋白酶的基因[31]。

3.2 研究深度

蛋白組學作為后基因時代主要研究任務之一已得到了迅速的發(fā)展，目前在肉品科學中也得到了廣泛應用[37-39]。Aldo等[40]利用蛋白質組學技術研究了發(fā)酵火腿在成熟過程中肌漿蛋白和肌原纖維蛋白的變化情況，雙向電泳法比SDS-PAGE法更為詳盡地闡述了蛋白質的變化。

由于蛋白質降解受基因調控，因此可通過蛋白組學來研究乳酸菌對肌肉蛋白質的降解作用，從分子水平認知乳酸菌的功能和作用機制[41]。Fadda等[26]利用研究清酒乳桿菌23 K在肌肉蛋白提取物中的生長適應性，使用雙向電泳技術，分析菌株在不同肌肉蛋白中生長72 h后其胞內(nèi)蛋白質組的變化情況，然后通過MALDI-TOF/MS鑒定具有顯著作用的調節(jié)蛋白。結果表明，從31 個表達點看，在有肌原纖維蛋白提取物存在時存在16 個點，而在有肌漿蛋白提取物存在時有6 個點，這與SDS-PAGE所得到的蛋白質降解模式具有相關性。當有肌原纖維蛋白提取物存在時，清酒乳桿菌23K會過度表達與能量和嘧啶代謝相關的蛋白質，同時也與丙氨酸和酪氨酸合成酶以及翻譯有關，而其他與普通應激反應以及嘧啶、維生素和輔因子的生物合成相關的蛋白表達受到了抑制。當應激蛋白處于調控狀態(tài)下，添加肌肉蛋白提取物可調整與翻譯、多肽/氨基酸代謝以及產(chǎn)能相關蛋白質的過度表達。這項研究加深了在有肌肉蛋白存在時，清酒乳桿菌23K的分子應激反應和生長機制的理解。我們需加深對這些調控基因功能性的研究，建立基因組序列和其生物學作用之間的連系，為篩選良好適應性的菌株，生產(chǎn)高質量的發(fā)酵產(chǎn)品提供基礎。在基因后時代，為了從基因數(shù)據(jù)獲得更多的信息，引進生物信息學是很關鍵的。蛋白質組學與轉錄分析表達結合之后，可提供更多有價值的基因和蛋白質。

4 結 語

在發(fā)酵過程中，肌肉蛋白質的降解與內(nèi)源性蛋白酶和乳酸菌的水解作用密切相關，除此之外，乳酸菌產(chǎn)酸代謝作用可促進其降解程度。在此過程中，肌漿蛋白比肌原纖維蛋白更易發(fā)生水解。分析這兩種蛋白質降解產(chǎn)生的多肽，表明它們與發(fā)酵特殊風味形成有關。今后的研究會沿著對多肽形成的機制方向進行，采用更多的檢測分析手段鑒定風味化合物。蛋白質組學的應用也可為乳酸菌在肌肉環(huán)境中適應性以及乳酸菌作用產(chǎn)生風味物質的機制研究提供分子生物學信息。

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Role of Lactic Acid Bacteria in Protein Degradation of Fermented Meat Products: A Review

CHEN Qian, HAN Qi, KONG Bao-hua*, XIA Xiu-fang, LIU Qian
(College of Food Sciences, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Lactic acid bacteria are one of the most common microorganisms in fermented meats. Hydrolysis of meat proteins is essential to the flavor development and quality improvement. This review provides a brief description of microbial enzymes involved in meat protein hydrolysis and their effects on meat quality characteristics as well as an overview of the role of lactic acid bacteria in degradation of sarcoplasmic and myofi brillar proteins in fermented meat products and simulated systems in vitro. Some disadvantages of recent research and future research trends are discussed. We hope that this paper could provide a value reference for the development of functional meat starter cultures.

lactic acid bacteria; fermented meat products; meat proteins; microbial enzymes; degradation

TS251.1

A

1002-6630（2014）09-0279-06

10.7506/spkx1002-6630-201409055

2013-07-04

國家自然科學基金面上項目（31271897）；公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201303082）

陳倩（1988—），女，博士研究生，研究方向為畜產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail：chenqianego7@126.com

*通信作者：孔保華（1963—），女，教授，博士，研究方向為畜產(chǎn)品加工。 E-mail：kongbh@163.com