吳軍林，吳清平*，張菊梅，張 文，莫樹平，柏建玲

（1.廣東省微生物研究所，省部共建華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省微生物菌種保藏與應用重點實驗室，廣東省微生物新技術公共實驗室，廣東 廣州 510070；2.廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，廣東 廣州 510643）

L-蘋果酸生物合成研究進展

吳軍林1,2，吳清平1,*，張菊梅1，張 文2，莫樹平1，柏建玲1

（1.廣東省微生物研究所，省部共建華南應用微生物國家重點實驗室，廣東省微生物菌種保藏與應用重點實驗室，廣東省微生物新技術公共實驗室，廣東 廣州 510070；2.廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，廣東 廣州 510643）

L-蘋果酸是生物體代謝過程中產生的重要有機酸，具有許多生物功能和生物活性，尤其在能量代謝方面對保護人類健康起著重要的作用。近年來微生物發(fā)酵法生產L-蘋果酸的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)，隨著蘋果酸生物合成途徑的闡明及其相關基因的克隆，運用基因工程手段調控微生物合成蘋果酸已成為可能。本文對蘋果酸生物合成代謝途徑及重要酶和相關基因的研究進展進行綜述，并對近年來蘋果酸產生菌的最新研究進行總結，最后展望了未來構建蘋果酸基因工程菌的研究方向。

微生物；發(fā)酵；L-蘋果酸；生物合成

L-蘋果酸（malic acid，L-羥基丁二酸）是一種重要的天然有機酸，廣泛分布于植物、動物與微生物細胞中，其口感接近天然蘋果的酸味，與檸檬酸相比酸度大、味道柔和、不損害口腔與牙齒，生理代謝上有利于氨基酸吸收、不積累脂肪，屬于新一代的食品酸味劑，被生物界和營養(yǎng)界譽為“最理想的食品酸味劑”，是目前世界食品工業(yè)中用量和發(fā)展前景較好的有機酸之一。L-蘋果酸是一種四碳酸，具有手性結構，因此一般以3種形式存在，即D-蘋果酸、DL-蘋果酸和L-蘋果酸，只有具有左旋結構的L-蘋果酸才能被生物體利用。L-蘋果酸是蘋果酸天冬氨酸穿梭的重要組成部分，對胞液和線粒體之間的還原當量（NADH）的轉移起重要作用[1]。因此，L-蘋果酸在機體內具有重要的代謝意義，同時具有顯著的生理功能，能夠有效的提高運動能力，具有抗疲勞、保護心臟、促進羧酸鹽的代謝、促進線粒體呼吸、改善記憶能力、增強鈣的活性、降低抗癌藥物毒副作用等生理功能，可應用于功能食品及醫(yī)藥產品中[2]。在食品工業(yè)中L-蘋果酸是繼檸檬酸、乳酸之后用量排第3位的食品添加劑，已廣泛用于高檔飲料、調味品、糖果等食品中。

由于L-蘋果酸屬于發(fā)酵生產的產品，安全性能有保障，因此，國際市場上需求量快速增加，近年來需求量保持在年均10%左右的高速度增長，市場發(fā)展空間巨大。目前世界蘋果酸主要生產國有美國、加拿大、日本等，世界總產量每年約為10萬t，其中L-蘋果酸產量每年約為4萬t，而世界市場潛在需求量達到每年6萬t[3]。目前我國最大L-蘋果酸生產廠家為常茂生物化學工程股份有限公司，生產方法為酶法生產?；瘜W合成法生產的蘋果酸，一般是以石油為原料，經(jīng)過化學合成的方法生產。主要包括反丁烯二酸或順丁烯二酸經(jīng)高溫高壓催化加水等幾種方法?；瘜W合成的蘋果酸為DL型，雖成本低廉，但不易吸收，有一定的毒性，不適于大量在食品與醫(yī)藥工業(yè)中應用。目前酶轉化法生產L-蘋果酸主要以富馬酸酶轉化為主，因此原料依然依賴于高純度化學合成的富馬酸，存在富馬酸原料價格昂貴、生產污染大、產品中雜酸含量偏高等缺點[4]。微生物發(fā)酵生產L-蘋果酸日益受到重視，具有原料來源豐富、產品成本低廉（約為酶法的1/4）、雜酸含量低（約為酶法的1/5）、食用安全性高等特點[5]。發(fā)酵法生產L-蘋果酸克服了對石化原料的依賴，被認為是最有前途的方法。

1 蘋果酸的生物合成途徑

圖1 曲霉細胞內4條合成L-蘋果酸途徑[[66]]Fig.1 Four possible pathways for malate production in Aspergillus[[66]]

目前研究發(fā)現(xiàn)L-蘋果酸在微生物細胞內有4條合成途徑（圖1）：1）丙酮酸羧化或磷酸烯醇式丙酮酸羧化為草酰乙酸，再還原為L-蘋果酸，該途徑的糖酸轉化率最大理論值為200%；2）由草酰乙酸與乙酰輔酶A合成檸檬酸后進入三羧酸循環(huán)生成L-蘋果酸，該途徑糖酸轉化率的最大理論值為100%；3）支路乙醛酸循環(huán)合成L-蘋果酸，該途徑糖酸轉化率的最大理論值為100%；4）延胡索酸由延胡索酸酶轉化生成L-蘋果酸，該途徑糖酸轉化率的最大理論值為133%[6]。

已有研究表明丙酮酸羧化支路途徑是曲霉等微生物積累L-蘋果酸的主要途徑[7]。郝夕祥等[8]從限氧發(fā)酵、碳酸鈣添加量、乙醛酸循環(huán)和TCA循環(huán)相應酶的抑制劑等幾個方面初步探討黃曲霉積累L-蘋果酸的代謝機制，發(fā)現(xiàn)丙酮酸羧化支路（二氧化碳固定途徑）是積累L-蘋果酸的主要途徑。限氧發(fā)酵時總酸下降15%左右，但L-蘋果酸在總酸中的比例大約上升了6%，在線粒體內進行的TCA循環(huán)和乙醛酸循環(huán)受到抑制，使得檸檬酸等雜酸的產量下降；在細胞質中進行的CO2固定途徑并未受到影響。發(fā)酵培養(yǎng)基中不添加碳酸鈣時，蘋果酸產量極少，培養(yǎng)基中碳酸鈣濃度逐漸增大，產酸水平也相應提高[9]。通過在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加琥珀酸（異檸檬酸裂解酶的反饋抑制劑），發(fā)酵產物中L-蘋果酸占總酸的比率基本沒有變化，排除了乙醛酸循環(huán)途徑在L-蘋果酸的合成中的主要作用。通過丙二酸、雙氧水、氯霉素對蘋果酸發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)TCA循環(huán)在黃曲霉SFW-7菌株積累L-蘋果酸中不占主導位置，并推測丙酮酸羧化支路（二氧化碳固定途徑）是積累L-蘋果酸的主要途徑。

周小燕等[10]研究表明，曲霉N1-14’胞質酶在發(fā)酵早期合成位于代謝途徑前端的丙酮酸羧化酶（pyruvate carboxlase，pyc）及胞質蘋果酸脫氫酶（malate dehydrogenase，mdh），后期合成琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，sdh），證實在曲霉N1-14’細胞內合成L-蘋果酸代謝流走的是丙酮酸羧化支路途徑，即圖1中草酰乙酸還原途徑，在丙酮酸羧化酶催化下，細胞線粒體內丙酮酸轉變?yōu)椴蒗Ｒ宜?，再由蘋果酸脫氫酶催化為L-蘋果酸。Osmani等[11-12]從丙酮酸羧化酶在細胞中的定位研究，發(fā)現(xiàn)構巢曲霉（Aspergillus nidulans）和少根根霉（Rhizopus arrhizus）等曲霉細胞內丙酮酸羧化酶主要存在于胞質中，丙酮酸羧化支路途徑是有機酸積累的機制；Zelle等[6]通過在丙酮酸脫羧酶缺陷型釀酒酵母中過表達內源性丙酮酸羧化酶基因、蘋果酸脫氫酶MDH3的等位基因及蘋果酸轉運蛋白基因SpMAE1，蘋果酸得率達到59 g/L，較出發(fā)菌株的12 g/L顯著提高。蘋果酸轉運蛋白（oxoglutarate-malate carrier，OMC）在蘋果酸和α-酮戊二酸進出線粒體過程中起到載體的作用[13]，因L-蘋果酸不能直接穿過線粒體到胞外，只能由位于線粒體膜上的蘋果酸轉運蛋白轉運到胞質中，蘋果酸轉運蛋白的轉運效率制約L-蘋果酸轉運到胞外的效率[14-15]。目前L-蘋果酸在微生物中代謝途徑方面的研究，大多認為二氧化碳固定反應是L-蘋果酸生成及積累的重要過程，有研究表明，曲霉胞質中羧化酶類合成的增多和減少是其活力增強或減弱的重要原因，從而引起L-蘋果酸生成速度加快或減慢，胞質中羧化酶蛋白分子的合成是產生蘋果酸的重要機制[16-17]。

2 蘋果酸合成途徑中的重要酶及相關基因

蘋果酸合成途徑中的重要酶是位于三羧酸循環(huán)途徑中的丙酮酸羧化酶、胞質蘋果酸脫氫酶及富馬酸酶。雖然蘋果酸酶也是調控蘋果酸代謝的關鍵酶，可以催化蘋果酸氧化脫羧的可逆反應，但在微生物合成蘋果酸代謝過程中并不起主導作用。尹升明等[18]利用農桿菌介導的轉化方法轉化黑曲霉，通過同源重組敲除黑曲霉蘋果酸基因，篩選蘋果酸酶基因敲除菌株，對其進行發(fā)酵實驗來研究蘋果酸基因在三羧酸循環(huán)中的作用，發(fā)現(xiàn)蘋果酸基因敲除菌株的三羧酸循環(huán)中各種有機酸的產量與野生菌株相比沒有明顯變化，表明蘋果酸酶基因的敲除對三羧酸循環(huán)沒有產生明顯影響。

2.1 丙酮酸羧化酶

丙酮酸羧化酶是一個生物素依賴性的四聚體酶，催化丙酮酸轉化為草酰乙酸的羧化過程。因pyc位于在細胞質中丙酮酸代謝的分支點，丙酮酸羧化酶是胞質中還原型（非線粒體中氧化型）三羧酸循環(huán)途徑的關鍵酶。真核生物中pyc一般位于線粒體內，而在一些絲狀真菌和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中pyc位于細胞質，對細胞積累高濃度的蘋果酸非常重要。通過添加影響pyc催化活性的物質，如抗生物素蛋白，可以使絲狀真菌和釀酒酵母積累高濃度的蘋果酸。釀酒酵母有兩個丙酮酸羧化酶基因，在氨基酸水平表現(xiàn)出90%的同源性，核苷酸水平表現(xiàn)出85%的同源性，在發(fā)酵生長期，缺失任何一個pyc基因對酵母細胞的生長影響不大，而同時敲除兩個pyc基因，只有在培養(yǎng)基中添加天門冬氨酸，酵母細胞才能正常生長[3]。

2.2 蘋果酸脫氫酶

蘋果酸脫氫酶催化蘋果酸與草酰乙酸之間的相互轉化。真核細胞中至少存在兩種形式的酶，根據(jù)不同的功能分為線粒體MDH和胞質MDH，而在釀酒酵母中存在的第3種蘋果酸脫氫酶（MDH3）位于核糖體。研究發(fā)現(xiàn)黃曲霉在連續(xù)培養(yǎng)6 d后，MDH的活性增加了6～10倍，富馬酸的活性變化不大，電泳分析發(fā)現(xiàn)線粒體MDH、胞質MDH及富馬酸酶存在于黃曲霉細胞，產酸過程中MDH電泳遷移率發(fā)生了變化，而富馬酸沒有變化，表明MDH表達與蘋果酸的生產具有很強的相關性，且MDH是產酸的一個限制因素。放線菌酮完全抑制L-蘋果酸的生產，主要同功酶的MDH并沒有增加，而不會影響總活性延胡索酸酶或其同工酶[19]。這些結果表明該同功酶是L-蘋果酸生產和積累關鍵酶。所有曲霉菌株均產生L-蘋果酸，已有研究發(fā)現(xiàn)產蘋果酸為主要有機酸的曲霉菌株（如米曲霉、黃曲霉、大豆疫霉和寄生曲霉）均存在MDH的一個特定電泳條帶，這種技術可以用來篩選高產L-蘋果酸的生產株菌[3]。

2.3 延胡索酸酶

延胡索酸酶又名富馬酸酶、蘋果酸裂合酶及延胡索酸水化酶，催化延胡索酸與蘋果酸之間相互轉化。目前發(fā)現(xiàn)存在兩種延胡索酸酶，一種是易與氧氣反應不穩(wěn)定的同源二聚體酶（class Ⅰ fumarases），存在于大腸桿菌及嗜熱脂肪芽孢桿菌中；另一種是穩(wěn)定的同源四聚體酶（class Ⅱ fumarases），存在比較廣泛。原核生物有3種形式的延胡索酸酶，分別由fumA、fumB及fumC編碼；真核細胞的延胡索酸酶存在于細胞質核線粒體基質中，由單個基因編碼。延胡索酸酶在酵母積累L-蘋果酸過程中所起的作用研究的比較清晰，釀酒酵母能夠產生的L-蘋果酸，而不產生延胡索酸，原因在于胞質中延胡索酸酶具有較高的活性，不斷催化延胡索酸轉化為蘋果酸，且反應不可逆[20]。E.coli中有兩個class Ⅰ fumarases基因（fumA和fumB），fumA在有氧條件下行使功能，而fumB在無氧條件下行使功能；以及一個class Ⅱ fumarases基因fumC，fumC在有氧和無氧條件下都可以表達，表達產物fumC的酶學性質和fumA類似，在脅迫環(huán)境中可以代替fumA的作用。

3 蘋果酸的產生菌

篩選或構建能用于工業(yè)化生產的高產菌株，并優(yōu)化出最佳培養(yǎng)條件是生物轉化法生產L-蘋果酸研究的熱點。改造L-蘋果酸產生菌的趨勢主要是用基因敲除技術改變菌株代謝途徑或利用基因擴增技術增加限速步反應的基因表達，增強菌株L-蘋果酸代謝途徑，同時強化表達L-蘋果酸轉運基因，最大限度的降低代謝產物在生產菌株細胞內的積累，篩選出高產菌株。在得到優(yōu)秀菌株的基礎上找到廉價底物，優(yōu)化發(fā)酵工藝和研究控制發(fā)酵條件使代謝流最大限度的流向L-蘋果酸。

與檸檬酸相比，微生物發(fā)酵法生產蘋果酸的菌種較少[21-22]，天然菌株的產酸能力低，對糖及底物的耐受性較差。L-蘋果酸高產菌株的選育工作主要集中于兩個方面：運用傳統(tǒng)的誘變方法，在特異性很強的選擇性平板上篩選L-蘋果酸高產菌株；運用分子生物學方法來構建基因工程菌，通過生物工程技術對菌種進行改造，這方面的研究已成為高產蘋果酸育種的主要工作的方向。

3.1 誘變篩選

蘋果酸是許多微生物的代謝中間體，可通過這類微生物的生理代謝活動由糖類或氨基酸而產生。產L-蘋果酸的微生物主要有：黃曲霉（Aspergillus flavus），最高產酸量達到113g/L，總轉化速率0.59g/（L·h）[23]。Z. rouxii最高產酸量達75g/L，總轉化速率0.54g/（L·h）[24]。S. cerevisiae最高產酸量達到59 g/L，總轉化速率0.19g/(L·h）[6]。何皓等[25]利用誘變米根霉(Rhizopus oryzae）ME-M15菌株發(fā)酵生產L-蘋果酸，最高產酸量21.7 g/L，總轉化速率0.23 g/（L·h）。劉建軍等[26]篩選出一株能直接利用淀粉的高產菌株HA5800，在7 000 L發(fā)酵罐中產酸量達86.8 g/L，糖酸轉化率達83.5%，有望成為工業(yè)化生產菌株。周小燕等[10,16]從出發(fā)菌株曲霉中選育出變異株N1-14’（Aspergillus sp. N1-14’），變異株產蘋果酸的能力達到105.88 g/L。目前已報道發(fā)酵產L-蘋果酸的菌種中最高產量的是黃曲霉，達到113 g/L，具有巨大的商業(yè)價值[27-28]。

3.2 蘋果酸基因工程菌的構建

3.2.1 大腸桿菌

Zhang等[29]在構建了生產琥珀酸的大腸桿菌（KJ060和KJ073）基礎上進一步敲除富馬酸還原酶構建的工程菌（XZ372和XZ316），其琥珀酸的產量減少了90%，即使在延胡索酸酶存在的情況下，該菌株蘋果酸的產量實現(xiàn)了大幅提高，丙酮酸的產量也相應的提高。僅敲除延胡索酸同功酶基因構建的工程菌（XZ273和XZ276）對蘋果酸的產量無影響。在工程菌XZ316細胞中敲除蘋果酸酶SfcA基因構建菌株XZ347，使細胞產率增加20%，且蘋果酸產量提高了3倍，達到70 mmol/L。在XZ347中敲除蘋果酸酶maeB基因構建菌株XZ654，蘋果酸產量有所下降（40 mmol/L），但蘋果酸產率有所增加，且副產物丙酮酸基本清除。在工程菌XZ654中敲除延胡索酸同功酶基因（fumB和fumAC）構建工程菌XZ658，細胞產量增加了128%，蘋果酸產量達到197 mmol/L，提高了4倍，但乳酸產量增加明顯。進一步敲除丙酮酸激酶基因pykA或pykB，乳酸產量下降同時蘋果酸的產量下降明顯，高產蘋果酸的大腸桿菌工程菌均缺乏延胡索酸還原酶。

3.2.2 枯草芽孢桿菌

Mu等[30]將來源于大腸桿菌的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和來源于釀酒酵母的蘋果酸脫氫酶克隆到枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）中構建工程菌BSUPM，有效建立了一個異源生物合成途徑，該工程菌L-蘋果酸產量達到（6.04±0.19）mmol/L。進一步敲除引起副產物乳酸產生的乳酸脫氫酶基因，構建了BSUPML基因工程菌，蘋果酸的產量增加了1.5倍，達到（9.18±0.22）mmol/L，通過優(yōu)化發(fā)酵條件，最大產量達到（15.65±0.13）mmol/L，這是在枯草芽胞桿菌工程菌中產L-蘋果酸的首次嘗試，為枯草芽孢桿菌產蘋果酸的基因工程研究奠定了基礎。

3.2.3 酵母

野生型的釀酒酵母蘋果酸產量一般只有1～2 g/L，近年來，隨著釀酒酵母基因工程菌研究的開展蘋果酸的產量提高很快。最初的釀酒酵母中敲除延胡索酸酶構建工程菌，發(fā)現(xiàn)蘋果酸脫氫酶的活性提高，使得蘋果酸的產量提高到6 g/L，進一步過表達胞質同功酶MDH2，使得蘋果酸的產量提高到12 g/L。Zelle等[6]通過在丙酮酸脫羧酶缺陷型釀酒酵母中過表達內源性丙酮酸羧化酶基因、蘋果酸脫氫酶MDH3的等位基因及蘋果酸轉運蛋白基因SpMAE1，通過搖瓶發(fā)酵蘋果酸得率達到59 g/L，較出發(fā)菌株的12 g/L顯著提高，進一步轉移到1 L發(fā)酵罐中擴大發(fā)酵，優(yōu)化pH值、CO2濃度、碳酸鈣及O24個工藝參數(shù)，蘋果酸轉化率比搖瓶增加19%以上[31]。Oba等[32]從清酒醪中分離出蘋果酸產生菌釀酒酵母，比較這些菌株與親本株DNA微陣列的基因表達時發(fā)現(xiàn)，蘋果酸生產菌株中的應激反應基因如HSP12，通常被上調，而硫胺素合成基因，如THI4和SNZ2，在高產蘋果酸菌株中被下調。因此，可以在釀酒酵母細胞中過表達應激反應基因，敲除硫胺素合成基因構建蘋果酸工程菌株。Nakayama等[33]研究釀酒酵母No. 28產蘋果酸機制時，發(fā)現(xiàn)在No. 28菌株及其親代菌株K1001合成蘋果酸過程中涉及的酶活性差異不大，但用羅丹明123進行細胞染色發(fā)現(xiàn)，No. 28菌株較親代菌株K1001淡，呼吸缺失菌株K1001的蘋果酸產量是野生型K1001和野生型No. 28菌株的2.5倍，表明菌株No. 28生產蘋果酸的主要機制是細胞線粒體活性受到抑制，為我們提示了一個利用釀酒酵母構建蘋果酸工程菌的研究方向。

4 展 望

利用基因工程菌發(fā)酵生產L-蘋果酸已成為一個重要的研究方向。通過對蘋果酸生物合成途徑的全面研究，可以有效指導生物合成途徑的遺傳修飾從而調節(jié)微生物對蘋果酸的生產、增加蘋果酸產量和提高蘋果酸的積累。在較好理解蘋果酸生物合成途徑的基礎上，利用遺傳工程和代謝工程對蘋果酸的代謝途徑進行重新設計，蘋果酸基因工程菌的構建思路主要包括兩個方面。1）加速限速反應：細胞內過表達丙酮酸羧化酶，增強丙酮酸轉化為草酰乙酸的反應；過表達蘋果酸脫氫酶，增強草酰乙酸轉化為L-蘋果酸的反應，提高L-蘋果酸在胞內的積累；2）改變分支代謝途徑流向：在細胞內敲除fum基因，阻止蘋果酸轉化為延胡索酸，敲除sdh基因，阻止副產物琥珀酸的生成。深入開展蘋果酸生物合成代謝調控研究不僅可以為提高蘋果酸產量的研究指明方向，也可為其他有機酸的研究奠定基礎。

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Progress in L-Malic Acid Biosynthesis

WU Jun-lin1,2, WU Qing-ping1,*, ZHANG Ju-mei1, ZHANG Wen2, MO Shu-ping1, BAI Jian-ling1
(1. Guangdong Institute of Microbiology, State Key Laboratory of Applied Microbiology of Southern China, Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application, Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology, Guangzhou 510070, China; 2. Guangdong Huankai Microbial Sci. & Tech. Co. Ltd., Guangzhou 510643, China)

L-malate, an important organic acid in the process of metabolism, is greatly beneficial to human health owning to its diverse biological functions. In recent years, the advantages of microbial fermentation for producing L-malic acid by are gradually emerging. The metabolic pathway of L-malic acid has been clarified and many related genes have been cloned. Therefore, the development of genetic engineering technologies has made it possible to improve the biosynthesis of L-malic acid. In this paper, the recent progress in the biosynthesis pathway of L-malic acid and the cloning of the genes encoding key enzymes involved in L-malic acid biosynthesis in microorganisms is reviewed, and the latest research on malic acidproducing strains is summarized. At last, we propose further directions and prospects in the construction of genetically engineered strains for malic acid biosynthesis.

microorganism; fermentation; L-malic acid; biosynthesis

TS201.2

A

1002-6630（2014）03-0238-05

10.7506/spkx1002-6630-201403048

2013-03-20

國家自然科學基金項目（31271940；31000762）；廣州市珠江科技新星專項（2013J2200079）

吳軍林（1978—），男，副研究員，博士，研究方向為食品與發(fā)酵工程。E-mail：tigerwjl@163.com

*通信作者：吳清平（1962—），男，研究員，博士，研究方向為食品安全與監(jiān)測。 E-mail：wuqp203@aliyun.com