王 華，賀金梅,2

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712；2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

黑曲霉孢子粉真空冷凍干燥保護(hù)劑配方優(yōu)化

王 華1，賀金梅1,2

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712；2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715）

采用單因素試驗(yàn)和混合均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)黑曲霉孢子粉真空冷凍干燥保護(hù)劑配方進(jìn)行篩選和優(yōu)化。通過(guò)Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到保護(hù)劑最佳配方為脫脂奶粉6.43 g/100 mL、蔗糖13.03 g/100 mL、甘油6.88 g/100 mL，孢子存活率預(yù)測(cè)值為88.82%，實(shí)際值為87.03%。

黑曲霉；保護(hù)劑；均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)；存活率

與液態(tài)微生物菌劑相比，固態(tài)微生物活菌劑，具有保藏期長(zhǎng)、不易污染，在運(yùn)輸、貯藏、質(zhì)量控制等方面有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[1-2]，還可直接作為發(fā)酵劑、添加劑研制開發(fā)其他雙歧保健食品和醫(yī)藥制劑等優(yōu)點(diǎn)，因而受到 愈來(lái)愈多的關(guān)注[3]。

目前關(guān)于菌種保藏的方法有真空冷凍干燥、噴霧干燥、流化床干燥、噴霧冷凍干燥等，在眾多的保藏方法中，因真空冷凍干燥法是在低溫、真空條件下進(jìn)行的，有利于提高菌種的成活率和保存時(shí)間。但真空冷凍干燥過(guò)程中，冷凍和干燥兩個(gè)過(guò)程會(huì)造成部分微生物細(xì)胞的死亡、損傷及某些酶蛋白分子的鈍化[4]，具體表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：冷凍過(guò)程中水結(jié)冰時(shí)體積增大以及冰晶的機(jī)械作用，易破壞細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)活性部位一些較弱的化學(xué)鍵；水結(jié)冰后溶質(zhì)濃度增加、pH值變化、離子強(qiáng)度增加、相分離；干燥過(guò)程中除去了與蛋白質(zhì)、磷脂等生物大分子結(jié)合的大部分水分子，易導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子變性失活，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能改變。因此，為減少冷凍和干燥過(guò)程中對(duì)細(xì)胞活性的影響，通常加入不同類型的保護(hù)劑。保護(hù)劑可以改變微生物干燥時(shí)的物理、化學(xué)環(huán)境，減輕或防止干燥或復(fù)水對(duì)細(xì)胞的損害，盡可能保持微生物原有的各種生理生化特性和生物活性[5-6]，進(jìn)而達(dá)到保護(hù)的目的，表1列出了常用的保護(hù)劑類型以及保護(hù)機(jī)理[7-18]。本實(shí)驗(yàn)以黑曲霉為發(fā)酵菌種，采用均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)黑曲霉冷凍干燥保護(hù)劑進(jìn)行優(yōu)化。

表1 保護(hù)劑類型及其保護(hù)機(jī)理Table 1 Cryoprotectant types and corresponding protection mechanismsnisms

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

黑曲霉（Aspergillus niger）2281 中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

菌種活化培養(yǎng)基：5°Bé麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：5°Bé麥芽汁1 000 mL、瓊脂15 g，自然pH值；菌落計(jì)數(shù)培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）：馬鈴薯300 g/L、葡萄糖20 g/L、瓊脂20 g/L、氯霉素0.1 g/L。

1.2 材料、試劑與儀器

脫脂奶粉 市售。

蔗糖（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚乙二醇（分析純） 天津天泰精細(xì)化學(xué)品有限公司；L-谷氨酸鈉（生化試劑）、甘油、乳糖、β-環(huán)狀糊精、硫酸錳、甘氨酸（均為分析純） 成都市科氏化工試劑廠。

ZHWY-200B恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海智城分析儀器制造有限公司；H1850R高速冷凍離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；VFD-2000冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工藝流程

1.3.2 菌種培養(yǎng)和孢子收集

菌種經(jīng)過(guò)活化、擴(kuò)大培養(yǎng)后，用無(wú)菌水洗下孢子，制備孢子懸液。

1.3.3 活孢子計(jì)數(shù)

稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法[19]，28～30℃培養(yǎng)48 h。

1.3.4 凍干后樣品的處里及孢子存活率計(jì)算

向凍干后樣品中加入10 mL無(wú)菌的生理鹽水，于37℃培養(yǎng)箱中放置15 min[20-21]；然后采用稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定樣品中的活孢子數(shù)。

1.3.5 真空冷凍干燥工藝

黑曲霉活化后，直接用無(wú)菌水洗下孢子，顯微鏡計(jì)數(shù)并調(diào)整其濃度為1×109CFU/mL的孢子懸液，活孢子數(shù)用稀釋平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定。于無(wú)菌的培養(yǎng)皿中加入2 mL孢子懸液，然后按保護(hù)劑與懸液體積比為2∶1的比例加入保護(hù)劑，保護(hù)劑與懸液平衡時(shí)間30 min；冷凍干燥各參數(shù)為：預(yù)凍溫度－40℃、預(yù)凍時(shí)間2 h、升華溫度－30℃、解析溫度25℃、干燥時(shí)間24h、真空度3～10Pa。

1.3.6 保護(hù)劑篩選

采用蔗糖、脫脂奶粉、乳糖、聚乙二醇、L-谷氨酸鈉、甘油、β-環(huán)狀糊精、硫酸錳、甘氨酸9種保護(hù)劑，將上述保護(hù)劑用蒸餾水分別配成不同質(zhì)量濃度的溶液，121℃滅菌20 min后于4℃冰箱中備用。以蒸餾水作對(duì)照，測(cè)定凍干前后活孢子數(shù)，計(jì)算孢子存活率，每組試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

1.3.7 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以孢子凍干存活率為試驗(yàn)指標(biāo)，對(duì)黑曲霉冷凍干燥保護(hù)劑效果較好的3種保護(hù)劑蔗糖、甘油、脫脂奶粉進(jìn)行混合均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)[22]，以確定真空冷凍干燥黑曲霉 孢子粉保護(hù)劑最佳配方，每組試驗(yàn)進(jìn)行3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一保護(hù)劑實(shí)驗(yàn)

圖1 保護(hù)劑對(duì)黑曲霉孢子凍干存活率的影響Fig.1 Effect of cryoprotectant type on survival rate of Aspergillus niger spores

由圖1可知，沒(méi)有添加任何保護(hù)劑的孢子凍干存活率只有10.07%，孢子凍干存活率隨著各種保護(hù)劑添加量的增加而增加；當(dāng)乳糖、蔗糖、β-環(huán)狀糊精、脫脂奶粉、L-谷氨酸鈉、甘氨酸、聚乙二醇、甘油、硫酸錳的質(zhì)量濃度分別為10、10、15、10、5、7、1、4、0.5 g/100 mL時(shí)，孢子凍干存活率最大，分別為27.81%、38.42%、22.49%、43.91%、28.51%、16.73%、25.05%、29.38%、12.75%。由于高質(zhì)量濃度的保護(hù)劑會(huì)加速細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)聚合，形成較強(qiáng)玻璃化結(jié)構(gòu)，反而不利于細(xì)胞的保存，且復(fù)水效果不好[23]，所以，當(dāng)保護(hù)劑的質(zhì)量濃度超過(guò)它們的最佳濃度后，孢子凍干存活率隨著各種保護(hù)劑添加量的增加反而下降。

其中蔗糖、脫脂奶粉、甘油對(duì)黑曲霉孢子凍干保護(hù)效果較好。蔗糖、甘油屬于滲透型保護(hù)劑，脫脂奶粉屬于非滲透型保護(hù)劑[24]。蔗糖、甘油能透過(guò)細(xì)胞壁，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)濃度升高，細(xì)胞內(nèi)壓力接近于細(xì)胞外壓力，降低細(xì)胞外干燥或凍結(jié)引起的細(xì)胞脫水皺縮的程度和速度，從而減少對(duì)細(xì)胞的損傷。脫脂奶粉主要是保護(hù)細(xì)胞的表面免受傷害，在凍干時(shí)使溶液呈過(guò)冷狀態(tài)，降低溶液結(jié)冰的速度，避免細(xì)胞在冷凍或加熱時(shí)由于鹽類濃縮，使細(xì)胞脫水而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的塌陷、滲透壓性休克、蛋白質(zhì)變性等不良后果[25]。另外，蔗糖、甘油又是親水性保護(hù)劑，它們的羥基基團(tuán)可與蛋白質(zhì)形成氫鍵，從而代替蛋白質(zhì)極性基團(tuán)周圍的水分子，使蛋白質(zhì)表面形成一層水化膜保護(hù)氫鍵，進(jìn)而穩(wěn)定蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)，防止蛋白質(zhì)因干燥而變性[26]。

單因素試驗(yàn)研究表明，其他幾種保護(hù)劑對(duì)黑曲霉孢子的保護(hù)效果都比較差，然而，即便是最佳質(zhì)量濃度的脫脂奶粉，孢子最大凍干存活率也只有43.91%，難以達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)凍干孢子粉的目的。通常情況下，幾種保護(hù)劑復(fù)合使用，保護(hù)效果要比單一保護(hù)劑的效果好。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選用蔗糖、脫脂奶粉、甘油3種保護(hù)劑進(jìn)行混合均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以凍干存活率為試驗(yàn)指標(biāo)，以確定真空冷凍干燥黑曲霉孢子粉保護(hù)劑最佳配方。

2.2 均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)

通過(guò)對(duì)脫脂奶粉、蔗糖、甘油3種保護(hù)劑對(duì)黑曲霉孢子凍干存活率的影響進(jìn)行均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果如表2所示。利用Design-Expert軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到二次回歸方程：Y=2.373 40+ 6.846 02X1+18.745 47X3+0.788 991X1X2－1.421 04X1X3－0.737 71X2X3－0.571

表2 黑曲霉孢子凍干保護(hù)劑均勻試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Uniform design and results for cryoprotectant optimization for for Aspergillus niger iger spores ores

由表3可得回歸方程顯著性檢驗(yàn)F= 122.71＞F0.01（6,5）= 10.67，即回歸方程顯著。由表4中標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)的絕對(duì)值，可得各因素對(duì)黑曲霉凍干存活率影響的主次順序?yàn)閄3＞X1＞X1X3＞X1X2＞X2X3＞。

對(duì)回歸方程求偏導(dǎo)，得最優(yōu)條件為X1=6.43、X2=13.02、X3=6.88，即當(dāng)脫脂奶粉、蔗糖、甘油的質(zhì)量濃度分別為6.43、13.03、6.88 g/100 mL時(shí)，黑曲霉孢子凍干存活率最大，達(dá)到88.82%。按照保護(hù)劑的最佳配方，3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)黑曲霉孢子凍干存活率平均值為87.03%，即凍干粉的活孢子數(shù)為4.3×109CFU/g，與預(yù)測(cè)值接近，無(wú)顯著差異，說(shuō)明所建立回歸模型合理。而丁春杰等[27]對(duì)黑曲霉菌絲體真空冷凍干燥進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)采用10 g/100 mL海藻糖和10 g/100 mL脫脂乳的復(fù)合保護(hù)劑時(shí)，能最大限度地提高菌絲體成活率，凍干菌粉中菌絲體含量也達(dá)到109CFU/g。海藻糖在高溫、高寒、高滲透、高壓及干燥失水等惡劣環(huán)境條件下在細(xì)胞表面能形成獨(dú)特的保護(hù)膜，有效地保護(hù)蛋白質(zhì)分子不變性失活，進(jìn)而提高細(xì)胞存活率，保護(hù)效果好。但海藻糖成本較高，而本實(shí)驗(yàn)采用較低成本的脫脂奶粉、蔗糖、甘油作為復(fù)合保護(hù)劑，凍干菌粉中孢子含量也達(dá)到4.3×109CFU/g。

由于儀器、操作人員不同、環(huán)境因素等影響，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在誤差，對(duì)于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)黑曲霉孢子粉，還需根據(jù)凍干設(shè)備性能、產(chǎn)量、能源、成本等諸多因素確定最佳的凍干保護(hù)劑配方。

表3 黑曲霉孢子凍干保護(hù)劑回歸方差分析Table 3 Analysis of variance for the regression model forcryoprotectant optimization for Aspergillus niger spores

表4 黑曲霉孢子凍干保護(hù)劑優(yōu)化回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 4 Signififi cance test of the regression coeffifi cients for cryoprotectant optimization for Aspergillus niger spores

3 結(jié) 論

本研究采用單因素試驗(yàn)和混合均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)黑曲霉孢子粉真空冷凍干燥保護(hù)劑配方進(jìn)行了篩選和優(yōu)化。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，蔗糖、脫脂奶粉、甘油的保護(hù)效果較好；通過(guò)回歸分析得到黑曲霉孢子粉真空冷凍干燥保護(hù)劑的二次回歸方程：Y=2.373 40+6.846 02X1+ 18.745 47X3+0.788 991X1X2－1.421 04X1X3－0.737 71X2X3－0.571 88。保護(hù)劑最佳配方為脫脂奶粉6.43 g/100 mL、蔗糖13.03 g/100 mL、甘油6.88 g/100 mL，3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)黑曲霉孢子凍干存活率平均值為87.03%。

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Optimization of Cryoprotectant Formulation for Vacuum Lyophilization of Spore Power of Aspergillus niger

WANG Hua1, HE Jin-mei1,2
(1. Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712, China; 2. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)

A cryoprotectant composed of skim milk powder, sucrose and glycerol for vacuum lyophilized spore power of Aspergillus niger was developed and its formulation was optimized by one-factor-at-a-time and uniform design. By regression analysis of the experimental data, the optimal cryoprotectant formulation (per 100 mL of cryoprotectant) found to consisted of 6.43 g of skim milk powder, 13.03 g of sucrose, and 6.88 g of glycerol. The predicted survival rate of spore with the addition of the optimized cryoprotectant after freeze-drying was 88.82%, which was close to the actual value of 87.03%.

Aspergillus niger; cryoprotectant; uniform design; survival rate

Q93.336

A

1002-6630(2014)01-0159-04

10.7506/spkx1002-6 630-201401031

2013-06-25

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（柑橘）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-27-05C）

王華（1963—），男，研究員，本科，研究方向?yàn)楦涕偕罴庸ぜ百A藏。E-mail：wanghua40@126.com