黃建琴，聶少平*，張莘莘，黃丹菲，朱科學(xué)，謝明勇

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047）

靈芝（Ganoderma lucidum）為擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝菌屬的藥食兩用高等真菌，是我國(guó)最具有研究?jī)r(jià)值的著名藥用真菌之一，也是一種新資源食品[1]。靈芝多糖是靈芝的主要活性成分，大量實(shí)驗(yàn)證明，靈芝多糖具有免疫增強(qiáng)和抗腫瘤作用[2-4]。黑靈芝又為靈芝中的極品，對(duì)人體保健具有的藥用療效遠(yuǎn)高于其他種類的靈芝[5]。

眾所周知，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與免疫密切相關(guān)。目前，國(guó)內(nèi)外大量研究表明靈芝多糖具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性[6-7]。實(shí)驗(yàn)證明，黑靈芝多糖（polysaccharides fromGanoderma atrum，PSG-1）對(duì)體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞無(wú)直接抑制作用，也不能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，但對(duì)體內(nèi)腫瘤有明顯的抑制作用[8]。但黑靈芝多糖抗腫瘤作用的確切機(jī)制，尤其是對(duì)巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程有何影響尚不清楚[9]。本實(shí)驗(yàn)利用腹水瘤S-180細(xì)胞建立荷瘤小鼠模型，收集S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞，探討黑靈芝多糖對(duì)S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）/細(xì)胞蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）、三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)/Ca2+及甘油二酯（diacylglycerol，DAG）/蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）信號(hào)通路的影響，進(jìn)而確定PSG-1對(duì)荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞的激活作用，為研究PSG-1抗腫瘤分子機(jī)制提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

黑靈芝（Ganoderma atrum）采自江西贛南靈芝生產(chǎn)基地，PSG-1由本實(shí)驗(yàn)制備，其純度＞99.8%。采用紅外光譜法、氣相色譜法、分子大小排阻色譜法、氨基酸分析儀以及高效液相色譜法測(cè)得該多糖主要由甘露糖、半乳糖以及葡萄糖組成，其物質(zhì)的量的比為1∶1.28∶4.91，平均分子質(zhì)量為1013kD[10]。

RPMI-1640培養(yǎng)基 北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清 美國(guó)HyClone公司；脂多糖 美國(guó)Sigma公司；小鼠IP3、DAG和cAMP ELISA試劑盒 上海西唐有限公司；鈣離子熒光探針試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；Anti-PKA、Anti-PKC抗體 美國(guó)Abcam公司；Antiβ-actin辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

電泳儀、凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；CO2培養(yǎng)箱、VARIOSKAN FLASH酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；超凈工作臺(tái) 吳江市凈化設(shè)備總廠；3K15-高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；高壓滅菌裝備 上海醫(yī)療器械廠。

1.2 細(xì)胞及動(dòng)物

腹水瘤S-180細(xì)胞株，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

BALB/c清潔級(jí)小鼠30只，雌性，體質(zhì)量（22±2）g，購(gòu)自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物的造模

用PBS將無(wú)菌收集的S-180細(xì)胞懸液濃度調(diào)節(jié)至1×106個(gè)/mL，用1mL一次性無(wú)菌注射器每只0.2mL接種于小鼠右肢腹溝處。靜養(yǎng)約1周后小鼠右肢處出現(xiàn)腫瘤塊，造模成功。

1.3.2 腹腔巨噬細(xì)胞的分離純化

造模成功后繼續(xù)靜養(yǎng)1周，待腫瘤塊如黃豆大小，取S-180荷瘤小鼠頸椎脫臼處死，放入碘伏3min，75%酒精中浸泡3min脫碘，用無(wú)菌注射器向腹腔注入5mL預(yù)冷的PBS緩沖液，用棉球輕柔腹部1～2min后吸取腹腔液于離心管中，重復(fù)沖洗腹腔3次，收集以上PBS，于1000r/min離心5min，棄上清沉淀物。再用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液重懸沉淀物并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，置CO2培養(yǎng)箱（5% CO2、37℃）培養(yǎng)4h后，輕輕吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗去未貼壁細(xì)胞，重復(fù)洗滌3次，即可得到純化的腹腔巨噬細(xì)胞[11-13]。

1.3.3 荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上清液中IP3、DAG和cAMP含量的測(cè)定

按上述方法制備的S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)拒染檢測(cè)其活性（＞95%），分別按每孔4×105個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，補(bǔ)充培養(yǎng)液至200μL，在細(xì)胞中加入PSG-1使其終質(zhì)量濃度為20、40、80、160μg/mL，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。置CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，收集上清。采用夾心ELISA法測(cè)定IP3、DAG和cAMP含量，具體操作方法按照相應(yīng)的試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.3.4 荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量測(cè)定

取腹腔巨噬細(xì)胞懸液按1×105個(gè)/mL細(xì)胞濃度接種于6孔板中，不同質(zhì)量濃度PSG-1刺激24h后，收集細(xì)胞，參照Fluo-3 AM（鈣離子熒光探針）試劑盒說(shuō)明處理收集的巨噬細(xì)胞，室溫下用PBS清洗細(xì)胞，再100μL PBS重懸細(xì)胞后避光保存，在流式細(xì)胞儀上檢測(cè)胞內(nèi)鈣離子含量。

1.3.5 荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞PKA及PKC表達(dá)水平的測(cè)定

取不同質(zhì)量濃度的PSG-1作用荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞24h后，收集細(xì)胞，參照總蛋白提取試劑盒說(shuō)明收集各組的蛋白，并用BCA法檢測(cè)蛋白含量。用Western blotting法測(cè)定PKA及PKC的表達(dá)量。在上樣緩沖液中煮沸5min進(jìn)行變性，然后將每個(gè)樣品裝載到10%的SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%奶粉在室溫下封閉1h，用一抗即抗PKA及抗PKC于4℃孵育過(guò)夜。TBST緩沖液洗滌后，在室溫下用適當(dāng)?shù)睦备^(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔抗體將膜孵育1h，再次洗滌后，用化學(xué)發(fā)光試劑覆蓋膜表面，ChemiDocXRS＋凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)PKA及PKC表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 PSG-1對(duì)S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IP3、DAG和cAMP的影響

由表1可見(jiàn)，PSG-1在終質(zhì)量濃度20～160μg/mL范圍內(nèi)作用24h后可促進(jìn)S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞生成IP3、DAG和cAMP，并顯著高于模型對(duì)照組，呈一定的劑量相關(guān)性。

表1 PSG-1對(duì)荷瘤小鼠脾腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生cAMP、DAG及IP3的影響lTable 1 Effects of PSG-1 on cAMP, DAG and IP production in peritoneal macrophages of tumor-bearing mice

2.2 PSG-1對(duì)S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量的影響

細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+是細(xì)胞內(nèi)重要的信使，其主要貯存于胞內(nèi)鈣庫(kù)（如肌細(xì)胞的肌漿網(wǎng)）和線粒體中。為了檢測(cè)PSG-1是否影響巨噬細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度，用PSG-1作用荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞24h后，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量。由圖1可知，與模型對(duì)照組相比PSG-1刺激后S-180荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度顯著增加，并呈劑量依賴性增強(qiáng)。其濃度依賴性關(guān)系如圖2所示。

圖1 PSG-1對(duì)荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Ca2+濃度的影響Fig.1 Effects of PSG-1 on Ca2+ flux in peritoneal macrophages of tumorbearing mice

圖2 荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞Ca2+濃度對(duì)應(yīng)的比例Fig.2 The corresponding proportion of Ca2+ flux in peritoneal macrophages of tumor-bearing mice

2.3 PSG-1對(duì)S-180荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)PKA及PKC表達(dá)水平的影響

PKA和PKC在受體介導(dǎo)的信號(hào)傳遞過(guò)程中起著重要作用。PKA又稱依賴于cAMP的蛋白激酶A，是一種結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單、生化特性最清楚的蛋白激酶。一般認(rèn)為，真核細(xì)胞內(nèi)幾乎所有的cAMP的作用都是通過(guò)活化PKA，從而使其底物蛋白發(fā)生磷酸化而實(shí)現(xiàn)的。PKC也是一種常見(jiàn)激酶，一般以非活性狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。由圖3、4可知，隨著PSG-1質(zhì)量濃度的增加，PKA及PKC表達(dá)水平增強(qiáng)，與模型對(duì)照組比較均有顯著增加。

圖3 PSG-1對(duì)荷瘤小鼠脾腹腔巨噬細(xì)胞PKA及PKC表達(dá)水平的影響Fig.3 Effect of PSG-1 on the protein expression levels of PKA and PKC in peritoneal macrophages of tumor-bearing mice

圖4 PKA及PKC表達(dá)量對(duì)應(yīng)的灰度值（n=33）Fig.4 The corresponding gray values of the protein expression levels of PKA and PKC (n = 3)

3 討 論

目前腫瘤是嚴(yán)重危害人類生命的疾病之一，對(duì)人類的健康有很大危害，其死亡率居高不下，尋找有效的預(yù)防和高效抗腫瘤藥物，仍然是科研工作者面臨的重要挑戰(zhàn)。大量研究表明，機(jī)體的免疫功能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關(guān)系[14]。巨噬細(xì)胞是免疫效應(yīng)細(xì)胞，具有多種免疫功能，包括免疫防御、免疫監(jiān)視、免疫調(diào)節(jié)以及抗原呈遞等，在機(jī)體的免疫系統(tǒng)中起著重要作用。

早期研究表明，絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated proteinkinases，MAPKs）區(qū)主要受酪氨酸激酶（tyrosine kinase，PKT）、PKC和PKA等激酶刺激活化[15]，而MAPK又參與多糖激活巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答[16]。所以，PKA及PKC參與多糖巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答。PKA被cAMP活化后，在ATP的存在下調(diào)節(jié)細(xì)胞的物質(zhì)代謝和基因表達(dá)，從而影響細(xì)胞的增殖和分化。PKC也在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和改變細(xì)胞的離子通道方面發(fā)揮著重要的作用。研究表明，PKA和PKC介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑涉及到多種細(xì)胞的存活和增殖[17]。那么，PSG-1是否通過(guò)cAMP/PKA、IP3/Ca2+及DAG/PKC信號(hào)通路的活化作用于患病小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞，從而改善患病小鼠的免疫能力，目前尚無(wú)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)對(duì)此進(jìn)行了探討。

cAMP是由腺苷酸環(huán)化酶催化ATP生成的；IP3和DAG由G-蛋白偶聯(lián)受體激活磷脂酶C生成IP3及DAG。DAG、IP3和cAMP是細(xì)胞內(nèi)常見(jiàn)的第二信使，參與激活細(xì)胞內(nèi)多個(gè)信號(hào)通路，引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)行細(xì)胞的應(yīng)答。cAMP主要是通過(guò)蛋白脂磷酸化作用繼續(xù)傳遞信息，將代謝途徑中的一些靶蛋白中的絲氨酸或蘇氨酸殘基磷酸化，將其激活或鈍化[18-19]。這些被共價(jià)修飾的靶蛋白往往是一些關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶或重要功能蛋白，因而可以介導(dǎo)胞外信號(hào)，調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)PSG-1處理后cAMP濃度顯著升高，同時(shí)PKA表達(dá)量也顯著增加。由此可以推斷，PSG-1可以激活荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)cAMP/PKA信號(hào)通路。

IP3和DAG功能分別是開(kāi)放胞內(nèi)鈣庫(kù)、激活Ca2+途徑和在Ca2+和磷脂酰絲氨酸存在下激活PKC。以肌醇磷脂代謝為基礎(chǔ)的細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)，最大的特點(diǎn)是胞外信號(hào)被膜受體接受后，同時(shí)產(chǎn)生兩個(gè)胞內(nèi)信使，分別激動(dòng)兩個(gè)信號(hào)傳遞途徑即IP3/Ca2+和DAG/PKC途徑[20-21]。細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)理論認(rèn)為：IP3通過(guò)作用于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上特異的受體使其內(nèi)部Ca2+釋放，引起胞內(nèi)Ca2+水平的增加，從而啟動(dòng)胞內(nèi)Ca2+信號(hào)系統(tǒng)，即通過(guò)依賴Ca2+、鈣結(jié)合蛋白的酶類活性變化來(lái)調(diào)節(jié)和控制一系列的生理過(guò)程。DAG通過(guò)激活PKC，以磷酸化的形式對(duì)許 多蛋白質(zhì)和酶類進(jìn)行修飾，從而調(diào)節(jié)和控制另外一系列的生理過(guò)程。兩條途徑相輔相成，又互相約束。 同時(shí)兩條通路信號(hào)的強(qiáng)弱又可根據(jù)原始信號(hào)的不同特征在細(xì)胞內(nèi)加以調(diào)節(jié)，而使細(xì)胞對(duì)這些外界 信號(hào)作出不同的反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在PSG-1刺激下，荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IP3和DAG量增加，且細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度及PKC表達(dá)量也顯著升高。由此可以說(shuō)明，PSG-1可以啟動(dòng)荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)IP3/Ca2+和D AG/PKC途徑。該兩條途徑在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程中可能共同協(xié)作，進(jìn)而激活荷瘤小鼠的腹腔巨噬細(xì) 胞，但需要進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，在相關(guān)研究表明PSG-1具有體內(nèi)抗腫瘤作用[8,22]及多糖對(duì)巨噬細(xì)胞 免疫應(yīng)答作用的研究基礎(chǔ)上[16]，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)接種S-180于小鼠右腹股溝處建立荷瘤小鼠模型，無(wú)菌分離荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞用于研究PSG-1對(duì)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路的影響，為進(jìn)一步研究PSG-1抗腫瘤機(jī)制提供參考。結(jié)果顯示，PSG-1可以激活荷瘤小鼠腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)cAMP/PKA、IP3/Ca2+及DAG/PKC信號(hào)通路，從而使患病小鼠免疫細(xì)胞發(fā)生一系列抵抗腫瘤的反應(yīng)。由此可以猜測(cè)，PSG-1通過(guò)作用于荷瘤小鼠巨噬細(xì)胞，激發(fā)細(xì)胞內(nèi)不同的信號(hào)通路，提高機(jī)體免疫能力從而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用。針對(duì)得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)室將進(jìn)一步研究細(xì)胞內(nèi)其他信號(hào)通路，最終確定PSG-1激活巨噬細(xì)胞的一系列通路。

[1]陳亞非, 陳金顯. 靈芝多糖免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤作用綜述[J]. 中國(guó)食品添加劑, 2002(4): 36-40.

[2]鄧海林, 吳佩穎, 王建新. 靈芝的研究進(jìn)展[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2005,16(2): 141-143.

[3]趙世華, 姚文兵, 龐秀炳, 等. 靈芝多糖分離鑒定及抗腫瘤活性的研究[J]. 中國(guó)生化藥物雜志, 2003, 24(4): 173-176.

[4]李松, 吳青華, 陳暢, 等. 多糖抗腫瘤活性的最新研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)生化藥物雜志, 2007, 28(3): 213-215.

[5]弓曉峰. 黑靈芝元素形態(tài) , 活性成分及其保健功能研究[D]. 南昌: 南昌大學(xué), 2006: 13-162.

[6]李文娟, 聶少平, 余強(qiáng), 等. 黑靈芝多糖對(duì)免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(19): 297-299.

[7]朱科學(xué), 聶少平, 李文 娟, 等. 黑靈芝多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖及誘生細(xì)胞因子的影響[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(19): 351-354.

[8]ZHANG Shenshen, NIE Shaoping, HUANG Danfei, et al.Immunomodulatory effect ofGanoderma atrumpolysaccharide on CT26 tumor-bearing mice[J]. Food Chemistry, 2013, 136: 1213-1219.

[9]LIU Gaoqiang, ZHANG Kechang. Mechanisms of the anticancer action ofGanoderma lucidum(Leyss. ex Fr.) Karst.: a new understanding[J].Journal of Integrative Plant Biology, 2005, 47(2): 129-135.

[10]CHEN Yi, XIE Mingyong, NIE Shaoping, et al. Purification,compo sition analysis and antioxidant activity of a polysaccharide from the fruiting bodies ofGanoderma atrum[J]. Food Chemistry, 2008,107(1): 231-241.

[11]ZHANG Jingsong, TANG Qingjiu, ZHOU Changyan, et al. GLIS, a bioactive proteoglycan fraction fromGanoderma lucidum, displays anti-tumour activity by increasing both humoral and cellular immune response[J]. Life Sciences, 2010, 87(19): 628-637.

[12]尹美珍, 李世普, 袁琳, 等. 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)與鑒定[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào): 醫(yī)學(xué)版, 2006, 27(2): 203-205.

[13]李海濤, 肖丹, 屈學(xué)民, 等. 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的分離與培養(yǎng)[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展, 2008, 8(4): 638-639.

[14]王統(tǒng)一, 趙兵, 王玉春. 多糖免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤研究進(jìn)展[J]. 過(guò)程工程學(xué)報(bào), 2006, 6(4): 674-682.

[15]YAMASHITA Y M, NAKASEKO Y, SAMEJIMA I, et al. 20S cyclosome complex formation and proteolytic activity inhibited by the cAMP/PKA pathway[J]. Nature, 1996, 384: 276-279.

[16]易陽(yáng), 曹銀, 張名位. 多糖調(diào)控巨噬細(xì)胞免疫應(yīng)答機(jī)制的研究進(jìn)展[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 33(11): 1267-1277.

[17]TANG Xinyan, ZHANG Caiqiao. Activation of protein kinases A and C promoted proliferation of chicken primordial germ cells[J]. Animal Reproduction Science, 2007, 101(3): 295-303.

[18]KOVO M, KANDI-COHEN M, BEN-HAIM M, et al. An active protein kinase A (PKA) is involved in meiotic arrest of rat growing oocytes[J]. Reproduction, 2006, 132(1): 33-43.

[19]SAZONOVA O V, BLISHCHENKO E Y, TOLMAZOVA A G, et al.Stimulation of fi broblast proliferation by neokyotorphin requires Ca2+influx and activation of PKA, CaMK II and MAPK/ERK[J]. FEBS Journal, 2007, 274(2): 474-484.

[20]VILLA I, dal FIUME C, MAESTRONI A, et al. Human osteoblastlike cell proliferation induced by calcitonin-related peptides involves PKC activity[J]. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism, 2003, 284(3): E627-E633.

[21]付志華, 李素平. TNF-α誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究[J]. 中國(guó)醫(yī)療前沿, 2013, 8(2): 1-3.

[22]梁軍, 李予蓉, 孫紀(jì)元, 等. 靈芝-912 對(duì)小鼠移植性腫瘤的抑制作用[J]. 中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 2003, 13(9): 11-13.