劉 鷺，潘道東*，丁 琳，曾小群

（寧波大學海洋學院食品系，浙江 寧波 315211）

多糖是一種由單糖聚合而成的天然高分子化合物，廣泛存在于植物、動物和微生物中[1]。乳酸菌是食品級的益生菌，其在生長過程中產生大量胞外多糖。乳酸乳球菌乳亞種（Lactococcus lactissubsp.lactis）是一種革蘭氏陽性菌，常被用于干酪生產。大量研究證實乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）具有免疫激活、抗腫瘤、降低血清膽固醇等作用[2-4]。硒是人體必需微量元素，適量補充硒元素可增強人體免疫能力[5]。通過化學修飾方法，亞硒酸鈉和多糖反應后形成一種含有亞硒酸酯鍵的硒化多糖。該多糖低毒且可提高小鼠免疫能力[6]。

Ca2+作為細胞內信號參與信息傳遞，在生物體內具有廣泛的作用，如突觸適應、神經遞質釋放、肌肉收縮、細胞分化和死亡等。細胞內游離Ca2+濃度的變化可引發(fā)細胞內一系列的生理生化反應[7-9]。巨噬細胞作為機體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在特異性免疫應答及非特異性免疫防御中起著關鍵的作用[10]。為進一步探討硒化乳酸菌胞外多糖的免疫功能，本實驗利用激光共聚顯微鏡及Fluo-3/AM探針研究該多糖對巨噬細胞、SGC-7901胃癌細胞及Hela細胞內游離Ca2+濃度的變化，以期為開發(fā)一種多糖補硒添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養(yǎng)基

精制EPS及硒化EPS（硒含量169.228μg/g） 本實驗室制備。

SGC-7901胃癌細胞、Hela細胞 武漢博士德生物工程有限公司；小牛血清 杭州四季青生物工程材料研究所；細菌脂多糖、Fluo-3/AM 美國Sigma公司；青霉素、鏈霉素、HEPES緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；其余化學試劑均為分析純。

RPMI 1640培養(yǎng)基、RPMI 1640無酚紅培養(yǎng)基 美國Gibco公司。

1.2 動物

ICR小鼠，體質量18～22g，雄性，8周，由寧波大學動物中心提供。

1.3 儀器與設備

370 FT-IR型傅里葉紅外光譜儀 美國Nicolet公司；MCO-18AIC CO2培養(yǎng)箱 日本Sanyon公司；飛鴿TDL-40C低速離心機 上海安亭儀器廠；倒置顯微鏡 日本Olympus公司；TCS SP5II激光共聚顯微鏡 德國萊卡公司。

1.4 方法

1.4.1 紅外光譜掃描

取適量硒化前或硒化后多糖粉末和溴化鉀混合研磨壓片，在4000～400cm-1范圍內掃描。

1.4.2 巨噬細胞分離與培養(yǎng)

每只小鼠提前3d注射體積分數(shù)為3%的巰基乙酸肉湯，3d后眼球放血，斷脊椎猝死小鼠。用體積分數(shù)為75%的酒精浸泡后，剖開腹部皮膚，注射8mL預冷的1640培養(yǎng)基，2min后來回抽取腹水兩次，收集細胞。1000r/min離心5min，細胞沉淀用RPMI 1640培養(yǎng)基清洗兩遍。用臺盼藍染色確定活細胞大于95%，調整細胞濃度為4×105cells/mL。在37℃、體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中貼壁3h后洗去非貼壁細胞得小鼠腹腔巨噬細胞[11-12]。

1.4.3 SGC-7901胃癌細胞培養(yǎng)

SGC-7901胃癌細胞為貼壁細胞，用含有體積分數(shù)為10%的FBS-RPMI1640培養(yǎng)，并用質量分數(shù)為0.25%的胰蛋白酶和0.02% EDTA混合液消化傳代，隔天換液，4d傳代一次。加藥物刺激前細胞處于穩(wěn)定生長狀態(tài)。

1.4.4 Hela 細胞培養(yǎng)

Hela細胞為貼壁細胞，用DMEM＋10% FBS培養(yǎng)，并用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA混合液消化傳代，每天換液，2d傳代一次。加藥物刺激前細胞處于穩(wěn)定生長狀態(tài)。

1.4.5 細胞內游離鈣離子[Ca2+]i測定

細胞貼壁后用Fluo-3/AM（終濃度5μmol/L）孵育45min，含鈣鎂離子的HEPES液清洗兩遍。置于激光共聚顯微鏡下，單通道激發(fā)波長488nm，吸收波長530nm。待穩(wěn)定后分別加入HEPES液或多糖（終質量濃度為100μg/mL）。每5s測定一次熒光強度，連續(xù)測定12min[13-14]。

2 結果與分析

2.1 紅外光譜掃描結果

圖1 乳酸菌胞外多糖硒化前后紅外光譜掃描對比圖Fig.1 Infrared spectra of EPS and Se-EPS

2.2 硒化乳酸菌胞外多糖對小鼠腹腔巨噬細胞內游離Ca2+的影響

由圖2可知，激光共聚顯微鏡下巨噬細胞穩(wěn)定后加入Se-EPS溶液，細胞內Ca2+熒光值緩慢升高并呈現(xiàn)動蕩變化趨勢；加入同濃度EPS后有微弱動蕩而加入HEPES液的對照組細胞內Ca2+熒光值無明顯變化。加入Se-EPS后巨噬細胞內的熒光強度明顯大于未加Se-EPS前巨噬細胞內的熒光強度。圖3為熒光顯微鏡下巨噬細胞的形態(tài)特征。

圖2 硒化多糖對小鼠巨噬細胞內Ca2+濃度影響Fig.2 Effect of Se-EPS from Lactococcus lactis subsp. lactis on [Ca2+]i in mouse macrophages

圖3 熒光顯微鏡下的巨噬細胞形態(tài)Fig.3 Effect of Se-EPS from Lactococcus lactis lactis subsp. on [Ca2+]i in mouse macrophages examined by fluorescence microscope

2.3 硒化乳酸菌胞外多糖對SGC7901胃癌細胞內游離Ca2+的影響

圖4 硒化多糖對SGC7901胃癌細胞內Ca2+濃度影響Fig.4 Effect of Se-EPS from Lactococcus lactis subsp. lactis on [Ca2+]i in gastric cancer cells SGC-7901

如圖4所示，對照組和多糖組細胞12min內Ca2+熒光強度無明顯變化。胃癌細胞加入Se-EPS后細胞內Ca2+熒光強度呈現(xiàn)持續(xù)動態(tài)下降趨勢。

2.4 硒化乳酸菌胞外多糖對Hela細胞內游離Ca2+的影響

圖5 硒化多糖對Hela細胞內Ca2+濃度影響Fig.5 Effect of Se-EPS from Lactococcus lactis subsp. lactis on [Ca2+]i in Hela cells

如圖5所示，Hela細胞加入Se-EPS后細胞內Ca2+熒光強度呈現(xiàn)持續(xù)動態(tài)下降趨勢，且下降幅度較大，接近60%，反應后階段細胞處于持續(xù)低鈣狀態(tài)。對照組和多糖組細胞內Ca2+熒光強度呈現(xiàn)動蕩變化，但幅度較小。

3 討 論

在機體內，Ca2+保持穩(wěn)態(tài)，對維持正常生理活動有重要作用。作為細胞內重要的第二信使，Ca2+參與多種細胞活動[12]。Ca2+濃度的升高是巨噬細胞激活的一個早期表現(xiàn)，進而引起細胞分化并分泌多種細胞因子，從而發(fā)揮其免疫細胞功能。對于腫瘤細胞而言，鈣內流的減少可使細胞生長終止[16]。Fluo-3/AM是一種Ca2+探針，其在細胞內被酯酶水解形成Fluo-3，后者與細胞內Ca2+結合后熒光強度增強[17-18]，因此，熒光強度的變化可相應地反映[Ca2+]i濃度的改變。本實驗利用Fluo-3/AM標記巨噬細胞及兩種腫瘤細胞，利用激光共聚顯微鏡技術測定硒化多糖的添加對這3種細胞內Ca2+濃度變化的影響。結果顯示硒化多糖可使巨噬細胞內Ca2+濃度緩慢升高，這提示通過對乳酸菌胞外多糖進行硒化修飾可增強其刺激巨噬細胞的能力，這可能是由于通過修飾改變了多糖的結構，使其可與細胞表面受體相結合，因而發(fā)揮其免疫功效。Ca2+作為細胞內的第二信使之一，通過檢查細胞內Ca2+濃度的大小可間接反映細胞的生理狀況。實驗中胃癌細胞與Hela細胞添加硒化多糖后，細胞內Ca2+水平均有不同程度的下降。這可能是硒化多糖與腫瘤細胞表面受體結合后引起細胞內Ca2+濃度減少，細胞長期處于低鈣水平細胞機能將受到嚴重影響。提示硒化后的多糖可引起腫瘤細胞不同程度的細胞凋亡。細胞內Ca2+濃度的變化與細胞外Ca2+的流動及細胞內鈣泵的作用有關[19-20]，硒化多糖引起免疫細胞及腫瘤細胞Ca2+變化的作用機制還需要更加深入的研究。

多糖通過硒化修飾得到的硒與多糖化合物結合了兩種物質的優(yōu)點，增加了多糖的免疫功能，并且提供了一種高效低毒的補硒劑。乳酸菌胞外多糖的硒化修飾在一定程度上改變了其生物活性以及作用機制，然而其對免疫功能的影響以及作用機制還需要進行更深層次的研究。

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