白 靖，姜金斗*，陶大利

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.農(nóng)業(yè)部乳品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，黑龍江 哈爾濱 150090）

酶水解-離子色譜法測定乳粉中多聚果糖含量

白 靖1，姜金斗2,*，陶大利2

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.農(nóng)業(yè)部乳品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，黑龍江 哈爾濱 150090）

建立果糖酶水解、離子色譜法測定乳粉中多聚果糖的方法。在醋酸緩沖溶液條件下加入果聚酶與葡聚酶，60 ℃水浴1 h，使多聚果糖與麥芽糊精全部分解為葡萄糖與果糖，然后用離子色譜-電化學(xué)檢測器分別測定酶解前后樣品中果糖及蔗糖的含量，從而計(jì)算多聚果糖的含量。色譜條件為：色譜柱PA-1（250 mm×4 mm，4.6 μm），梯度洗脫，流速0.8 mL/min；標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.348 8＋3.694 0x，r=0.999 9（果糖）；y=0.174 8＋4.350 4x，r=0.999 7（蔗糖）。樣品平均回收率為97.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.56%。果糖和蔗糖的定量限分別為1.3、1.2 ng/mL。該方法具有樣品處理簡便、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可以用于調(diào)制乳粉及嬰幼兒配方乳粉中多聚果糖含量的測定。

乳粉；果聚酶；多聚果糖；離子色譜

多聚果糖是從菊苣根中提取的、具有保健功能的低聚糖，由α-果糖以β-1,2糖甙鍵連接，在其末端接一個(gè)葡萄糖殘基而形成的，分子式為（C6H12O6）-（C6H10O5）n（n=2～60），平均聚合度（average degree of polymerization）≥23，相對分子質(zhì)量344～11 400。多聚果糖是一種優(yōu)良的水溶性膳食纖維，可以預(yù)防便秘與結(jié)腸癌、降低血液膽固醇、穩(wěn)定血糖水平；同時(shí)還是一種很好的“益生元”，具有調(diào)節(jié)腸道菌群、增殖雙歧桿菌、促進(jìn)鈣的吸收、促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、抗齲齒等保健功能，可減少肝臟毒素，能在腸中生成抗癌的有機(jī)酸，有顯著的防癌功能[1]。多聚果糖被譽(yù)為抗生素時(shí)代后最具潛力的新一代添加劑——促生物質(zhì)，在法國被稱為原生素（hormone maternelle）。我國GB 14880—2012《食品營養(yǎng)強(qiáng)化劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[2]中規(guī)定嬰幼兒配方食品、嬰幼兒谷類輔助食品、兒童及孕產(chǎn)婦乳粉中多聚果糖的用量不超過64.5 g/kg。

多聚果糖的測定方法文獻(xiàn)報(bào)道較少，主要測定方法有液相色譜法、離子色譜法、分光光度法、酶聯(lián)免疫試劑盒法等[3-27]。由于嬰幼兒乳粉及調(diào)制乳粉中碳水化合物主要含有葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖及麥芽糊精等，成分復(fù)雜，碳水化合物總含量大都在50%以上，而強(qiáng)化的多聚果糖含量一般僅為0.5%～2.0%，甚至不足0.1%，采用色譜法測定多聚果糖其干擾物質(zhì)較多，且能測定聚合度為2～4的低聚果糖部分[4,6,11-18]；酶聯(lián)免疫法通過測定樣品酶解前后果糖與蔗糖含量，進(jìn)而計(jì)算得出多聚果糖含量，因試劑盒的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性等原因，其結(jié)果的準(zhǔn)確性與重復(fù)性不甚理想；美國AOAC標(biāo)準(zhǔn)[6-7]中制定的總果聚糖離子色譜法與分光光度法使用β-淀粉酶、普魯蘭酶、麥芽糖酶、外切菊粉酶、內(nèi)切菊粉酶等多種酶酶解后測定，操作步驟復(fù)雜、結(jié)果重復(fù)性差；多聚果糖本身成分復(fù)雜，主要是由聚合度為2～60的果聚糖組成，其中低聚果糖（聚合度為2～8）可溶于乙醇，而更高聚合度的果聚糖則屬于不溶于乙醇，因此乙醇提取并沉淀蛋白方式也不適用于乳粉類樣品中多聚果糖的測定，多聚果糖只能采用果聚酶水解的間接方法測定。

本實(shí)驗(yàn)建立的方法經(jīng)果聚酶水解、離子色譜-電化學(xué)檢測器測定酶解前后果糖與蔗糖的含量，計(jì)算樣品中多聚果糖（含低聚果糖）的含量，操作簡單、重復(fù)性和準(zhǔn)確性好、成本低，可以滿足乳品企業(yè)出廠檢驗(yàn)與品控及質(zhì)監(jiān)部門監(jiān)督的需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醋酸鈉、醋酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸天津科密歐公司；葡聚酶 美國Sigma公司；果糖酶瑞士Fluka公司；蔗果四糖 日本W(wǎng)ako公司；果糖、蔗糖 國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。

1.2 儀器與設(shè)備

HPAE-PAD離子色譜儀 美國Dionex公司；Sevenmulti酸度計(jì) 瑞士Mettler Toledo公司；DK-8AX水浴鍋 上海一恒公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

醋酸緩沖液（pH 4.5）：0.2 mol/L醋酸鈉溶液220 mL和0.2 mol/L醋酸溶液280 mL混合后稀釋到1 L；磷酸鹽緩沖液（pH 4.5）：分別稱取1.24 g KH2PO4、7.27 g K2HPO4溶解于1 L去離子水中，用磷酸調(diào)pH值至4.5；葡聚酶（30～60 U/mg）、果糖酶（26.6 U/mg）：用磷酸鹽緩沖液溶解配制成酶含量分別為1 mg/mL；0.5 mg/mL蔗果四糖標(biāo)準(zhǔn)溶液：稱取50 mg標(biāo)準(zhǔn)品用水溶解并定容至100 mL；標(biāo)準(zhǔn)儲備液：分別準(zhǔn)確稱取果糖和蔗糖（真空干燥箱55 ℃，4 h）標(biāo)準(zhǔn)品各100 mg（精確至0.1 mg），用水溶解并定容至100 mL，4 ℃冰箱可保存1個(gè)月；果糖與蔗糖混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液至果糖質(zhì)量濃度分別2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 ?g/mL，蔗糖質(zhì)量濃度分別為0.5、2.0、4.0、6.0、10.0 ?g/mL。

1.3.2 樣品處理

稱取約5 g樣品（精確至0.1 mg）于錐形瓶中，加入40 mL 45～55 ℃蒸餾水溶解樣品，冷卻至室溫后轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中定容至刻度并混勻。A液：吸取10 mL樣液于50 mL試管中，加入10 mL醋酸緩沖液、1 mL果糖酶溶液混勻（若樣品中含有麥芽糊精再加入1.5 mL的葡聚酶溶液），60 ℃水浴1 h。B液：吸取10 mL樣液于50 mL試管中，加入10 mL醋酸緩沖液。待A液取出并冷卻后，將A、B液分別過濾后放于4 ℃冰箱過夜充分酶解。從冰箱中取出濾液緩至室溫后分別吸取1 mL至100 mL容量瓶中用去離子水定容至刻度，0.2 μm濾膜過濾。

吸取10 mL蔗果四糖標(biāo)準(zhǔn)溶液及10 mL醋酸緩沖液混勻后加入1 mL果糖酶溶液，設(shè)置不同水解時(shí)間（30、45、50、55、60、75、90 min）進(jìn)行水解后，分別測定蔗果四糖含量，以確定最佳水解時(shí)間。

吸取10 mL蔗果四糖標(biāo)準(zhǔn)溶液及10 mL醋酸緩沖液混勻后加入不同體積的果糖酶溶液（0.5、1.0、1.5、2.0 mL），60 ℃水浴1 h后，分別測定蔗果四糖含量，以確定最佳酶用量。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Dionex PA-1（250 mm×4 mm，4.6 μm）；保護(hù)柱：Dionex PA-1（50 mm×4 mm，4.6 μm）；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量2 0 ? L；流動相：A為12.5 mmol/L NaOH溶液，B為125 mmol/L NaOH溶液，C為125 mmol/L NaOH-0.5 mol/L NaAc溶液；梯度洗脫條件：0～30 min，A∶B∶C=85∶15∶0（V/V，下同）；30～36 min，A∶B∶C=0∶0∶100；36～51 min，A∶B∶C=85∶15∶0；電化學(xué)檢測器條件：0.00～0.40 min，電壓0.05V，0.20 min開始積分，0.40 min積分結(jié)束；0.41～0.60 min，電壓0.75V；0.61～1.00 min，電壓－0.15V。

分別將樣液與果糖和蔗糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液注入離子色譜測定相應(yīng)的峰高，外標(biāo)法定量。

1.3.4 多聚果糖含量計(jì)算方法

平均聚合度按28、果糖折算成多聚果糖系數(shù)為0.90計(jì)算。

式中：X為多聚果糖含量/（g/kg）；A1為水解后果糖測定含量/（g/kg）；A2為水解前果糖測定含量/（g/kg）；A3為水解前蔗糖測定含量/（g/kg）。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品處理的優(yōu)化

2.1.1 緩沖鹽體系

選用pH 4.5的酸度條件處理樣品，可使蛋白質(zhì)變性以去除蛋白質(zhì)，同時(shí)也為酶水解提供了適宜的酸度條件。醋酸鹽緩沖液與磷酸鹽緩沖液條件下，酶水解效果有一定差異，其多聚果糖測定結(jié)果分別為7.58 g/kg與7.21 g/kg，因此醋酸鹽緩沖液優(yōu)于磷酸鹽緩沖液。

2.1.2 酶解溫度與時(shí)間

根據(jù)文獻(xiàn)[7-8]及果聚酶的特點(diǎn)，適宜的酶解溫度應(yīng)為60 ℃左右。實(shí)驗(yàn)表明，不同的酶水解時(shí)間對水解效果影響明顯（表1），酶解時(shí)間在1 h及以上時(shí)可以達(dá)到全部水解的效果，本實(shí)驗(yàn)選用60 ℃、1 h作為酶解溫度與時(shí)間。

表1 酶水解時(shí)間對多聚果糖測定結(jié)果的影響Table1 Effect of enzymatic hydrolysis time on results of determination of polyfructose

2.1.3 果聚酶使用量及葡聚酶的使用

果聚酶的活性及用量是影響酶解效率的重要因素。結(jié)果表明，在60 ℃保持1 h的條件下，酶用量低于1 mg時(shí)，低聚果糖測定結(jié)果偏低；用量大于1 mg時(shí)基本無變化，最終選用加入1 mg果聚酶（表2）。

表2 果聚酶用量對樣品多聚果糖含量測定結(jié)果的影響Table2 Effect of polymerase dosage on results of determination of polyfructose in samples

由于嬰幼兒配方乳粉及調(diào)制乳粉中常含有大量的麥芽糊精，會給樣品處理帶來困難，同時(shí)也可會增加測定干擾，降低測定靈敏度，因此需要葡聚酶降解。由于葡聚酶的水解條件與果聚酶基本相同，在使用果聚酶處理樣品的同時(shí)加入葡聚酶即可使麥芽糊精降解為葡萄糖。結(jié)果表明，用此處理方法后即可得到澄清的樣液，其降解產(chǎn)物葡萄糖也不影響果糖等的定量測定。

2.2 樣品測定

圖1 嬰幼兒配方乳粉酶水解前（A）、后（B）的色譜圖Fig.1 Chromatograms of infant formula before and after the enzymatic hydrolysis

采用1.3.3節(jié)中給出的流動相與檢測器條件樣品進(jìn)行測定，其結(jié)果證明蔗糖、果糖與其他組分實(shí)現(xiàn)了有效分離，且基線噪聲低、測定靈敏度高，可滿足多聚果糖的測定（圖1）。

2.3 線性范圍與定量限

在1.3.3節(jié)色譜條件下，分別測定果糖與蔗糖的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。結(jié)果表明，在該范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度x與峰面積y呈良好的線性關(guān)系，果糖的線性回歸方程為y=0.348 8＋3.694 0x，r=0.999 9；蔗糖的線性回歸方程為y=0.174 8＋4.350 4x，r=0.999 7。果糖與蔗糖的定量限（RSN=5）分別為1.3、1.2 ng/mL。

2.4 方法的回收率和精密度

選取不含多聚果糖的中老年奶粉添加不同量的多聚果糖后測定其含量（添加前測定的多聚果糖的含量為6.96 g/kg），每個(gè)添加水平測定3次，計(jì)算回收率；含有多聚果糖的嬰兒配方奶粉與兒童奶粉處理液分別進(jìn)樣6次，測定精密度。樣品平均回收率為97.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.56%（表3、4）。

表3 樣品中多聚果糖回收率測定結(jié)果Table3 Recovery of polyfructose in spiked samples

表4 精密度測定結(jié)果Table4 Precision of the analytical method

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立采用酶水解-離子色譜法測定乳粉中多聚果糖的方法。通過對樣品前處理方法的優(yōu)化，確定了采用醋酸緩沖液處理、加入1 mg果糖酶、60 ℃水浴1 h使多聚果糖完全水解。通過測定水解前后果糖與蔗糖的含量即可計(jì)算出樣品中多聚果糖的含量。果糖與蔗糖測定的定量限分別為1.3、1.2 ng/mL。對于含有麥芽糊精的樣品，需加入葡聚酶水解成葡萄糖，以去除因麥芽糊精造成樣液過濾困難及濾液渾濁的問題，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證加入葡聚酶水解后對多聚果糖的測定無影響。該方法具有樣品處理簡單、重復(fù)性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

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Determination of Polyfructose Content in Milk Powder by Enzymatic Hydrolysis Coupled with Ion Chromatography

BAI Jing1, JIANG Jin-dou2,*, TAO Da-li2
(1. School of Food, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China; 2. Dairy Quality Supervision and Testing Center, Ministry of Agriculture, Harbin 150090, China)

This study is intended to develop an analytical method to determine polyfructose in milk powder using enzymatic hydrolysis combined with ion chromatography. Fructanohydrolase and glucose polymerase were added to acetate buffer and incubate in 60 ℃ water bath for 1 h to completely decompose polyfructose and maltodextrin into glucose and fructose. The contents of fructose and sucrose before and after the enzymatic hydrolysis were analyzed by ion chromatography with electrochemical detection so that the content of the polyfructose could be calculated from the measured results. Chromatographic separation was carried out on a PA-1 column (250 mm×4 mm, 4.6 μm) by gradient elution at a fl ow rate of 0.8 mL/min. The calibration curve was y = 0.348 8＋3.694 0x, r = 0.999 9 for fructose, and y = 0.174 8＋4.350 4x, r = 0.999 7 for sucrose. The average recovery was 97.4% with a relative standard deviation of 3.56%. Limit of quantifi cation was 1.3 ng/mL for fructose and 1.2 ng/mL for sucrose. This method was simple, sensitive, reproducible and applicable to determine polyfructose in modifi ed milk powder and infant formula.

milk powder; fructanohydrolase; polyfructose; ion chromatography

TS207.3

A

1002-6630（2014）02-0257-04

10.7506/spkx1002-6630-201402050

2012-10-09

白靖（1982—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩?。E-mail：kqzjjzlk@163.com

*通信作者：姜金斗（1960—），男，研究員，碩士，研究方向?yàn)槭称穬x器分析與安全。E-mail：jjindou@163.com