胡立立，楊 蟬，史 蕙*，許乾麗，王 烈

（1.貴陽醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550004；2.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002；3.貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 貴陽 550004）

HPLC-DAD法測定粗糧饅頭中6種合成色素

胡立立1，楊 蟬2，史 蕙3,*，許乾麗3，王 烈2

（1.貴陽醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550004；2.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550002；3.貴州省食品藥品檢驗(yàn)所，貴州 貴陽 550004）

建立一種簡便、快速、重復(fù)性好的高效液相色譜-二極管陣列檢測器測定粗糧饅頭中的檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、日落黃、亮藍(lán)6種合成色素的含量。選用無水乙醇-氨水-水（7∶2∶1，V/V）為樣品的提取溶劑，色譜柱為Waters Symmetry?C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，多波長同時(shí)測定6種的合成色素，檢測波長分別為425、483、520、620 nm。流動(dòng)相以甲醇為A相，以含0.02 mol/L乙酸銨、1%冰醋酸和0.2%三乙胺溶液（pH 4）為B相，進(jìn)行梯度洗脫。結(jié)果表明：6種合成色素均達(dá)到基線分離，具有良好的線性關(guān)系（r=0.999 9）；樣品的檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、日落黃、亮藍(lán)加標(biāo)回收率分別為97.94%、96.40%、96.28%、97.63%、98.80%、100.40%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2.0%。該方法可用于甄別是否由染色而成的粗糧饅頭。

高效液相色譜-二極管陣列檢測器；粗糧饅頭；合成色素；檢測

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及人民生活水平的提高，人們對食品的精細(xì)度及營養(yǎng)的追求發(fā)生著巨大改變，并不局限產(chǎn)品白、細(xì)膩及柔軟。目前市售的雜糧有玉米、黑米、高粱、谷子、黍子、蕎麥、燕麥、大麥及豆類，面粉中摻入了一定雜糧粉制作成雜糧饅頭。雜糧饅頭中因雜糧粉有著特殊的營養(yǎng)成分，正逐漸被廣大消費(fèi)者接受。但是上?！叭旧z頭”事件的發(fā)生，證實(shí)目前一些不法商販為了謀取利潤，在面粉中添加合成色素冒充玉米、高粱、蕎麥等雜糧饅頭。偽造玉米、高粱、蕎麥、燕麥饅頭可能由黃色、紅色、藍(lán)色等幾種合成色素調(diào)制而成。常用的黃色色素有檸檬黃和日落黃，常用的紅色色素有莧菜紅、胭脂紅和誘惑紅，常見的藍(lán)色色素有亮藍(lán)。人體過量的攝入合成色素后會(huì)在體內(nèi)蓄積分解成致突變原前體芳香胺類化合物，有些甚至可能轉(zhuǎn)化形成致癌物質(zhì)，對食用者的健康危害極大[1-4]。依據(jù)我國GB 2760—2011《食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中對檸檬黃、日落黃、胭脂紅、誘惑紅、莧菜紅、亮藍(lán)6種合成色素的允許使用品種、使用范圍以及最大使用量（或殘留量）作出了明確規(guī)定。這6種合成色素可用作糕點(diǎn)表面的彩裝，但禁用于主食食品中。而使用合成色素?fù)郊?、偽造粗糧饅頭是典型的對消費(fèi)者欺詐行為。目前我國國標(biāo)[5-7]中測定合成色素的方法主要有薄層色譜法[8-9]、高效液相色譜法[10-22]、示極波譜法[23-24]和分光光度法[25-26]。因此建立簡便、快捷、準(zhǔn)確的分析方法檢測饅頭中的合成色素具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)旨在建立同時(shí)測定粗糧饅頭中6種合成色素的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

粗糧饅頭（生產(chǎn)批號：130106、130108、130119、130398、130565、130566、130625、130710、130830、130885）來源于貴州省食品藥品檢驗(yàn)所。

甲醇（色譜純） 美國Tedia試劑公司；乙酸銨（色譜純） 美國Mreda公司；冰醋酸（分析純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氨水（分析純） 重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司；三乙胺（分析純） 成都市科龍化工試劑廠；檸檬黃、日落黃、胭脂紅、誘惑紅、莧菜紅、亮藍(lán)6種合成色素標(biāo)準(zhǔn)品 德國Dr.Ehrenstorfer GmbH公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20A液相色譜儀（LC solution色譜工作站、二極管陣列檢測器） 日本島津公司；TGL6-ws臺(tái)式高速離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；BT2202S電子分析天平 德國Sanorius公司；KQ5200DE型超聲波清洗器 江蘇昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜分析條件

色譜柱：W a t e r s S y m m e t r y?C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長：425、483、520、620 nm；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相以甲醇為A相，以含0.02 mol/L乙酸銨溶液、1%冰醋酸和0.2%三乙胺溶液（pH 4）為B相，進(jìn)行梯度洗脫程序；流速：1.0 mL/min。檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、日落黃、亮藍(lán)6種合成色素的理論塔板數(shù)分別為18 275.21、24 463.96、71 780.31、118 230.44、88 358.43、226 193.51；拖尾因子數(shù)分別為1.20、1.36、124、1.16、1.18、1.17。

表1 6種合成色素的較佳洗脫梯度程序Table1 Optimal elution conditions for six kinds of synthetic pigments by HHPPLLCC

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液

分別精密稱取檸檬黃對照品（批號90813，含量90.0%）0.010 59 g、莧菜紅對照品（批號20291，含量99.0%）0.010 33 g、胭脂紅對照品（批號91120，含量70.0%）0.014 13 g、誘惑紅對照品（批號80917，含量83.0%）0.012 46 g、日落黃對照品（批號91001，含量87.0%）0.011 32 g、亮藍(lán)對照品（批號20705，含量82.1%）0.010 97 g分別置100 mL量瓶中，以水溶解并定容至刻度，搖勻，制得相應(yīng)質(zhì)量濃度分別為95.31、102.27、98.91、103.42、98.48、98.27 ?g/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液。

1.3.3 混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液

分別精密吸取檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液5 mL、莧菜紅標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液8 mL、胭脂紅標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液8 mL、誘惑紅標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液8 mL、日落黃標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液15 mL、亮藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液5 mL至50 mL量瓶中，制得相應(yīng)質(zhì)量濃度分別為9.73、16.70、16.15、16.88、30.15、10.03 ?g/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。

1.3.4 樣品供試溶液的制備

試樣處理：取50 g樣品，用刀切碎成碎末，稱取約20 g，置食物粉碎機(jī)中，打碎成粉末（過40目篩），作為供試樣品。

稱取供試樣品4.00 g（準(zhǔn)確至0.01g），置100 mL量瓶中，加入無水乙醇-氨水-水（7∶2∶1）溶液約80 mL，置超聲波中超聲30 min，取出，放置室溫，用無水乙醇-氨水-水（7∶2∶1）溶液定容，搖勻，取上清液濾過，棄去約10 mL初濾液，精密吸取續(xù)濾液50 mL置蒸發(fā)皿中，水浴蒸至近干，以水溶解殘?jiān)⑥D(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，以水定容，搖勻。轉(zhuǎn)移至離心管中，5 000 r/min離心5 min，取上清液作為樣品供試溶液。

1.3.5 模擬樣品供試溶液的制備

通過多次模擬試驗(yàn)，當(dāng)面粉中含檸檬黃2.45 mg/kg、日落黃7.73 mg/kg、莧菜紅3.88 mg/kg、胭脂紅4.02 mg/kg、誘惑紅4.04 mg/kg、亮藍(lán)2.37 mg/kg混勻后的樣品與市售高粱、蕎麥饅頭顏色相似。故選擇該樣品為模擬供試樣品。根據(jù)1.3.4節(jié)操作步驟制備成模擬樣品供試溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜峰的歸屬

根據(jù)1.3.1節(jié)色譜條件，獲得對照品混標(biāo)溶液及模擬陽性樣品溶液色譜圖見圖1、2。

圖1 6種合成色素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混標(biāo)Fig.1 HPLC chromatogams of mixed standards of synthetic pigments

圖2 模擬陽性樣品色譜圖Fig.2 HPLC chromatogams simulated positive sample

2.2 混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限

分別吸取1.3.3節(jié)標(biāo)準(zhǔn)使用溶液1、3、5、7、9、10 mL置10 mL量瓶中，得到一系列相應(yīng)質(zhì)量濃度，進(jìn)樣10 ?L于高效相色譜分析。以各組分進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制線性關(guān)系圖，得回歸方程。以信噪比法（RSN=3）考察6種色素的最低檢出限?？梢?種色素在其一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見表2。

表2 6種合成色素的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table2 Linear equations and limits of detection （LLOODD） for siixx kinds of synthetic pigments

2.3 精密度和回收率

準(zhǔn)確稱取模擬陽性樣品4.00 g（準(zhǔn)確至0.01 g）添加色素標(biāo)準(zhǔn)品量分別為檸檬黃2.43 mg/kg、日落黃7.53 mg/kg、莧菜紅4.17 mg/kg、胭脂紅4.04 mg/kg、誘惑紅4.22 mg/kg、亮藍(lán)2.51 mg/kg。根據(jù)1.3.4節(jié)試樣測定步驟進(jìn)行測定，平行測定6次，計(jì)算回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表3可見，6種合成色素的回收率在96.28%～100.40%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.90%～1.90%之間。

表3 6種合成色素的回收率、精密度（n==66）Table3 Recoveries and RSDs of six kinds of synthetic pigments from spiked sampleess ((nn == 66))

2.4 實(shí)際樣品的測定

應(yīng)用本研究建立的方法對10批不同批號的粗糧饅頭產(chǎn)品中的6種合成色素進(jìn)行測定，進(jìn)樣體積為20 ?L，結(jié)果見表4。

表4 粗糧饅頭中6種合成色素含量的檢測Table4 Contents of six kinds of pigments in commercial steamed breads of coarse grains as determined by this method mg/kg

2.5 供試樣品提取方法的選擇

2.5.1 提取溶劑的選擇

合成色素是水溶性化合物，因此在試驗(yàn)過程中分別考察水、無水乙醇-氨水-水（7∶2∶1）兩種提取溶劑對6種合成色素進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水作為提取溶劑的各合成色素的回收率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于無水乙醇-氨水-水（7∶2∶1），故選用無水乙醇-氨水-水（7∶2∶1）來提取樣品中的合成色素。

2.5.2 提取方法的選擇

目前對于合成色素的提取方法大多數(shù)選擇是聚酰胺吸附法，也是GB/T 5009.35－2003《食品中合成著色劑的測定》中所采用的。但是在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)實(shí)際樣品中雜質(zhì)較少，基本無雜質(zhì)干擾峰。就此而言采用聚酰胺吸附法是既耗時(shí)又浪費(fèi)試劑，而且操作步驟繁瑣。在試驗(yàn)過程中比較了超聲提取和聚酰胺吸附法兩種方法，結(jié)果表明前者的回收率和精密度都比后者好。同時(shí)需要注意的是混合纖維素脂膜對合成色素具有吸附作用從而影響回收率。故最后選擇超聲提取30 min后濾過在棄去10 mL初濾液后在收集提取液，水浴揮干，以水定容后離心取上清液進(jìn)樣。

2.6 檢測波長的選擇

使用紫外分光光度計(jì)分別對誘惑紅、檸檬黃、日落黃、莧菜紅、亮藍(lán)、胭脂紅進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果見圖3。

圖3 6種合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)品的紫外光譜掃描圖Fig.3 UV-Visible spectra of six kinds of synthetic pigments

由圖3可以得出，6種合成色素在254 nm波長附近處都有較強(qiáng)吸收，但樣品中的雜質(zhì)在其相應(yīng)處同樣有吸收，干擾極大，甚至?xí)?dǎo)致誤識，影響檢測結(jié)果。因此排除末端吸收，確定了檸檬黃的測定波長為425 nm，日落黃的測定波長為483 nm，莧菜紅、胭脂紅和誘惑紅的測定波長為520 nm，亮藍(lán)的測定波長為620 nm。較GB/T 5009.35—2003的測定第一法中選定的254 nm基線平穩(wěn)，目標(biāo)物能夠得到有效分離，且實(shí)際樣品無干擾峰。

2.7 色譜柱與流動(dòng)相的選擇

在試驗(yàn)過程中分別對Waters X-Bridge phenyl（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Hypersil GoLd Dima（4.6 mm×150 mm，5 μm）、Hypersil ODS2（5.0 mm×150 mm，5 μm）及Waters Symmetry?C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）對6種合成色素分離的效果進(jìn)行考察。并且在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)依據(jù)GB/T 5009.35—2003中梯度洗脫程序標(biāo)樣中的一些色素峰分離不完全。對甲醇和0.02 mol/L乙酸銨溶液不同時(shí)間梯度洗脫對各組分的分離效果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)各組分的峰形存在拖尾現(xiàn)象；胭脂紅和日落黃未完全分開；亮藍(lán)未完全分離的現(xiàn)象。故在水相中加入適量的三乙胺和冰醋酸，最后確定以Waters Symmetry?C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）為色譜柱，甲醇和0.02 mol/L乙酸銨溶液、1%冰醋酸和0.2%三乙胺溶液（pH 4）梯度洗脫時(shí)間如表1所示。各組分的分離度大于1.5，分離度較好。

3 結(jié) 論

本研究采用高效液相色譜法測定粗糧饅頭中6種合成色素的含量，在樣品的前處理技術(shù)和色譜條件進(jìn)行了簡化，減少樣品分析繁瑣的實(shí)驗(yàn)步驟，提高了操作的簡便快捷性。從線性范圍、回收率、精密度等方面進(jìn)行考察，證實(shí)6種合成色素在本色譜條件下分離效果好、回收率高。且適合粗糧饅頭中合成色素的含量的檢測。通過對實(shí)際樣品的檢測結(jié)果來分析，可知目前市售的粗糧饅頭的質(zhì)量參差不齊，存在著添加合成色素以假亂真的現(xiàn)象，對人民的飲食健康存在著安全隱患。

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Determination of Six Kinds of Synthetic Pigments in Chinese Steamed Bread of Coarse Grains by High Performance Liquid Chromatography with Diode Array Detection

HU Li-li1, YANG Chan2, SHI Hui3,*, XU Qian-li3, WANG Lie2
(1. Guiyang Medical University, Guiyang 550004, China; 2. Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China; 3. Institute for Food and Drug Control of Guizhou Province, Guiyang 550004, China)

A high performance liquid chromatography with diode array detection (HPLC-DAD) method for determining the synthetic pigments tartrazine, amaranth, carmine, temptation, sunset yellow and bright blue in Chinese steamed bread of coarse grains with simple pretreatment, high sensitivity and good repeatability was proposed in this study. Samples of steamed bread were extracted with a mixture solvent composed of absolute ethanol, ammonia water and pure water (7:2:1, V/V) and the extracts were separated on a Waters Symmetry?C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) at a flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 35 ℃. HPLC chromatograms were detected at 425, 483, 520 and 620 nm, respectively. Mobile phase A was methanol and mobile phase B consisted of 0.02 mol/L ammonium acetate, 1% acetic acid and 0.2% triethylamine in water (pH 4). A gradient elution program was used. Baseline separation was achieved for all six kinds of synthetic pigments, providing a good linear relationship (r = 0.999 9). The recoveries from spiked samples for tartrazine, amaranth, carmine, temptation, sunset yellow and bright blue were, respectively, 97.94%, 96.40%, 96.28%, 97.63%, 98.80% and 100.40% with RSD less than 2.0%. This method is useful to discriminate undyed from dyed steamed breads of coarse grains.

high performance liquid chromatographic with diode array detection (HPLC-DAD); Chinese steamed bread; synthetic pigments; detection

TQ617.1；O657.72

A

1002-6630（2014）02-0222-05

10.7506/spkx1002-6630-201402043

2013-09-11

貴州省科技廳科技計(jì)劃課題（黔科合SY字[2011]3090號）；貴州省食品、保健食品和化妝品監(jiān)測檢測平臺(tái)課題（黔科平臺(tái)[2012]4001號）；國家食品藥品監(jiān)督管理局研究課題

胡立立（1986—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称匪幤焚|(zhì)量控制關(guān)鍵技術(shù)。E-mail：540217252@qq.com

*通信作者：史蕙（1962—），女，副主任藥師，碩士，研究方向?yàn)樗幤焚|(zhì)量。E-mail：Shihui169@126.com