李 杰，馬曉潔，杜小波，馮 崗，譚榜憲△

(1.四川省綿陽市中心醫(yī)院腫瘤科，四川 綿陽621000;2.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院腫瘤科，四川 南充637000)

腫瘤的生長需要血液供應，內(nèi)皮細胞所構成的血管是腫瘤獲取血供的主要形式。近年來，關于惡性食管間質(zhì)瘤、肺癌、胃癌、視網(wǎng)膜母細胞瘤［1～4］等多種惡性腫瘤的研究均提到了一種區(qū)別于經(jīng)典血管生成途徑的全新的腫瘤微循環(huán)模式——血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)。多數(shù)研究結果認為VM 是腫瘤患者預后的不利因素。VM 的形成不依賴于血管內(nèi)皮細胞，而在特定的微環(huán)境中由腫瘤細胞表達部分內(nèi)皮細胞表型，通過自身變形與細胞外基質(zhì)相互作用，模擬正常血管生成途徑取代內(nèi)皮細胞形成可以輸送血液的微循環(huán)管道。本研究應用免疫組化及特殊染色法觀察原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PLC)組織中VM 的表達，結合患者的隨訪資料，探討VM 表達與PLC 患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院2007 年6 月至2010 年8 月手術治療、經(jīng)病理學確診的196例PLC 患者的術后標本，排除非肝癌原因死亡(包括術中死亡、住院期間并發(fā)癥死亡)，以及年齡大于80 歲或小于18 歲的患者，共納入術前未接受放、化療(包括肝動脈介入治療)，臨床病理資料完整的161 例，對照組選擇15 例病理明確的PLC 癌旁組織。161 例中男122 例，女39 例;年齡23 ～78 歲，中位年齡54 歲;肝細胞肝癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)138 例，膽管細胞癌15 例，混合型8 例;臨床分期Ⅰ～Ⅱ57 例，Ⅲ～Ⅳ104 例。肝細胞癌Edmondson 分級:Ⅰ～Ⅱ57 例、Ⅲ～Ⅳ81 例;伴有肝硬化的患者45 例。分期標準采用AJCC/UICC 第七版(2009)分期法，病理分級根據(jù)Edmondson 分級法，將Ⅰ～Ⅱ級合并為高分化組，Ⅲ～Ⅳ級合并為低分化組。

1.2 研究方法

1.2.1 CD31-PAS 雙重染色 取蠟塊腫瘤組織連續(xù)切片，明確診斷、分化程度以及是否合并肝硬化。CD31 小鼠抗人單克隆抗體(產(chǎn)品編號:ZM-0044)免疫組化染色按照PV6000 免疫組化染色試劑盒(產(chǎn)品編號:PV-6000)步驟進行，直至DAB 顯色后顯微鏡控色，待內(nèi)皮細胞著色后(棕黃色)，流水沖洗1 min 終止顯色。在此基礎上行PAS 特染:0.5%高碘酸溶液中還原10 min，流水沖洗2 min 后置于Schiff液中，避光環(huán)境下反應10 ～15 min，蒸餾水沖洗兩次，每次1 min，流水沖洗2 min。蘇木素淺染細胞核、鹽酸酒精分化、返藍、脫水透明、中性樹膠封片。PAS 染液(產(chǎn)品編號:SP-0002)購自北京中杉金橋生物技術公司;DAB 顯色劑(產(chǎn)品編號:AR1022)購于武漢博士德公司。

1.2.2 VM 判定標準 CD31 陽性(棕黃色)的管腔判定為內(nèi)皮血管或肝血竇;CD31 陰性的管腔，外附PAS 陽性(淡紅色)的細胞外基質(zhì)，管腔內(nèi)有紅細胞，結合HE 染色進一步觀察判定為VM 陽性。膽管細胞癌中VM 陽性的切片需進一步與膽管結構進行鑒別，管壁不完整，管壁細胞形態(tài)不規(guī)則、管腔內(nèi)可見血細胞、管壁外附PAS 陽性的細胞外基質(zhì)為VM 陽性。

1.2.3 隨訪 通過書信、電話、門診、入戶調(diào)查等方式進行全面隨訪，隨訪時間截止到2011 年11 月20日，隨訪終點為死亡、失訪及生存至截止日期。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0 軟件包進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗或Fisher 確切概率法。行列表資料的關聯(lián)性分析用χ2檢驗。生存率采用壽命表法。生存分析及生存曲線采用Kaplan-Meier(Log-rank)法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 VM 表達及PLC 預后情況 161 例PLC 共有61 例表達VM(37.9%)，對照組15 例無VM 表達。VM 管壁由腫瘤細胞交錯排列而成，管腔內(nèi)可見紅細胞，視野內(nèi)可見CD31 染色陽性的內(nèi)皮血管(圖1)。161 例PLC 生存時間最長的為60 個月，最短的為1 個月，中位生存時間18 個月。VM 表達陽性者中位生存時間較陰性者少18.6 月，1、2、3 年的生存率分別為56%、40%和26%，生存分析顯示其與VM表達陰性者差異有統(tǒng)計學意義(Log-rank=10.705，P=0.001)，說明VM 的表達陽性縮短了患者的生存時間(表1、圖2)。

圖1 VM 在原發(fā)性肝癌中的表達 a:肝細胞癌(HE 染色×400)癌細胞核較大，分化程度較低，部分肝細胞呈空泡狀。黑色箭頭為內(nèi)皮血管，管腔內(nèi)可見血液細胞。紅色箭頭為肝癌細胞圍成的管道，部分管壁缺如，符合VM 的特征;b:膽管細胞癌CD31-PAS 雙染(×400)，黑色箭頭標記為VM，構成VM 管壁的細胞呈梭形，CD31 染色陰性，管腔內(nèi)可見血細胞。紅色箭頭所指棕黃色的管腔為CD31 陽性的內(nèi)皮血管;c、d:肝細胞癌中CD31-PAS 雙染(c×200;d×400)，黑絲箭頭為VM，構成管壁的細胞CD31 染色陰性，VM 管壁外附有一層被PAS 染成淺紅色的基質(zhì)，管腔內(nèi)可見血細胞

2.2 VM 表達與各臨床病理因素及生存率的關系關聯(lián)性分析結果顯示，各臨床病理因素中年齡、性別、HbsAg、病理分級以及是否合并肝硬化與患者的1、2、3 年生存率無關(P＞0.05)。VM 的表達與PLC 的TNM 分期、腫瘤大小及肝細胞癌Edmondson分級有關(P值分別為0.025、0.032 和0.006);肝硬化與VM 的表達存在明顯的相關性(χ2=8.284，P=0.004)，見表2。Ⅲ～Ⅳ期、同一腫瘤體積分組(≥5 cm，＜5 cm)PLC 患者以及HCC 患者1、2、3 年的生存率與VM 的表達存在明顯的相關性，見表3、圖2。

表1 不同臨床病理PLC 患者的預后比較

圖2 VM 陽性組和陰性組的生存曲線

表2 PLC 患者VM 表達與各臨床及病理因素的關系

3 討論

我國肝細胞癌(以下簡稱肝癌)發(fā)病率與死亡率居世界首位，在我國是第2 位的癌癥殺手，全球第3 位癌癥死因［5］。肝臟是血供豐富的器官，因此肝臟腫瘤具有生長迅速、易發(fā)生血行轉(zhuǎn)移、預后差等特點。肝臟腫瘤血供形式多樣，VM 和血管內(nèi)皮細胞依賴型血管生成都是腫瘤細胞血液供應的形式，VM 是為了適應腫瘤細胞迅速生長導致缺氧或營養(yǎng)不足的產(chǎn)物。CD31 是內(nèi)皮細胞標記物，本研究利用CD31 免疫組化染色標記內(nèi)皮細胞，聯(lián)合PAS 特殊染色，在肝臟腫瘤組織觀察到了CD31 染色陰性PAS 特染陽性的VM 表達。本研究證實了PLC 組織中存在VM 表達，VM 的表達是PLC 患者預后的不利因素。

表3 VM 與生存率的關系

本研究中混合型肝癌 VM 陽性率最高(62.5%)，HCC 中VM 陽性表達率為36.2%，不同病理類型VM 的表達沒有統(tǒng)計學差異。由于膽管細胞癌和混合型肝癌樣本量少，有待進一步研究證實PLC 三種病理類型VM 表達是否存在差異。本研究中VM 表達陽性率為37.9%，高于趙秀蘭等［6］對VM 在HCC 組織表達情況的報道(12.12%)，這種差異可能源自病理類型上的不同。本研究中有23例非肝細胞肝癌，VM 表達陽性率達到40%以上，而HCC 中VM 陽性表達率則為36.2%。國外關于PLC 與VM 的報道并不多見，Guzman 等［7］報道了20 例HCC 中有11 例觀察到VM 表達(55%)。不同地區(qū)的研究結果都證實肝癌組織中VM 的表達，但各結果間的差異說明VM 的表達還受到地域性等其他因素影響。

本研究生存分析結果提示，VM 陽性表達能顯著降低患者的生存時間，VM 表達陽性者中位生存時間較陰性者少18.6 月。經(jīng)過分層分析，在相同條件下比較，VM 陽性組1、2、3 年的生存率低于陰性組，進一步說明VM 的表達是PLC 預后的不利因素。Baeten 等［8］對結直腸癌的研究證實，VM 的存在能明顯縮短患者的生存時間，并推斷VM 是一種獨立的預后因素影響結直腸癌患者的生存率。Vartanian 等［9］對腎透明細胞癌研究也證實VM 是一種影響患者預后的獨立因素，它的存在能增加患者腫瘤復發(fā)的風險。Li 等［10］研究認為，存在VM 的患者有經(jīng)過血道進行遠處轉(zhuǎn)移的傾向，腫瘤的惡性程度也較無VM 者高，并且具有更短的生存率。這些相關的研究都得出了VM 是患者預后不良的獨立因素，與本研究結果一致。我們認為聯(lián)合檢測VM及其相關蛋白的表達對評價PLC 預后有一定指導意義。本研究中同一腫瘤體積或分期中VM 陽性組生存率顯著低于陰性組，該分層分析進一步說明VM 表達陽性是患者PLC 預后的不利因素，導致PLC 患者生存時間縮短。

VM 的發(fā)現(xiàn)，豐富了人們對腫瘤細胞可塑性及腫瘤血管生成的認識。顯然，VM 不能取代內(nèi)皮細胞依賴性血管在腫瘤血供形式中的主導地位，僅僅是腫瘤微循環(huán)的補充，但其廣泛的臨床意義也為腫瘤抗血管生成治療帶來了新的思路。目前對VM 的研究尚處于初級階段，進一步探討腫瘤微環(huán)境中VM 的形成機制將是今后研究的重點，通過抑制VM的形成，是否能延長患者的生存時間值得期待。

［1］Hui Zhao，Xiao-Meng Gu. Study on vasculogenic mimicry in malignant esophageal stromal tumors［J］.World J Gastroenterol，2008，14(15):2430-2433.

［2］韓義明，王靜，王國平，等. 肺癌組織中血管生成擬態(tài)和HIF-1α的表達及意義［J］. 臨床與實驗病理學雜志，2008，24(3):269-272.

［3］Li M，Gu Y，Zhang Z，et al.Vasculogenic mimicry:a new prognostic sign of gastric adenocarcinoma［J］.Pathol Oncol Res，2010，16(2):259-266.

［4］Niu YJ，Liu FL，Yang Y，et al. Relationship between vasculogenic mimicry and clinical pathological characters in retinoblastoma［J］.Zhonghua Yan Ke Za Zhi，2009，45(4):318-322.

［5］樊嘉，王征. 肝癌外科治療的進展［J］. 實用醫(yī)院臨床雜志，2011，8(1):16-19.

［6］趙秀蘭，杜靜，張詩武，等. 肝細胞肝癌中血管生成擬態(tài)的研究［J］.中華肝臟病雜志，2006，14(1):41-44.

［7］Guzman G，Cotler SJ，Lin AY，et al. A pilot study of vasculogenic mimicry immunohistochemical expression in hepatocellular carcinoma［J］.Arch Pathol Lab Med，2007，131(12):1776-1781.

［8］Baeten CI，Hillen F，Pauwels P，et al.Prognostic role of vasculogenic mimicry in colorectal cancer［J］.Dis Colon Rectum，2009，52(12):2028-2035.

［9］Vartanian AA，Stepanova EV，Gutorov SL，et al. Prognostic significance of periodic acid-Schiff-positive patterns in clear cell renal cell carcinoma［J］.Can J Urol，2009，16(4):4726-4732.

［10］Li M，Gu Y，Zhang Z，et al.Vasculogenic mimicry:a new prognostic sign of gastric adenocarcinoma［J］.Pathol Oncol Res，2010，16(2):259-266.