魏付橋，申清香，劉昌化，羅康寧，謝文彪，胡 軍

(1.南華大學附屬第二醫(yī)院胃腸外科；湖南 衡陽 421001；2.南華大學附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科；3.南華大學附屬第二醫(yī)院心胸外科)

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，全世界每年新發(fā)病例可達120萬人以上，在我國，由于飲食結(jié)構(gòu)的改變，其發(fā)病率也有逐年遞增的趨勢。結(jié)腸癌起病隱匿，90％以上患者死于癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[1]。腫瘤細胞從原發(fā)灶脫落，并降解細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的最重要病理生理改變，而此過程與基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的活性密切相關(guān)[2]。因此，以MMPs為研究靶點，探索抑制MMPs活性的治療藥物，對結(jié)腸癌的治療具有重要意義。

異硫氰酸苯乙酯(phenethyl isothiocyanate,PEITC)異硫氰酸脂的一種，廣泛存在于橄欖，花椰菜等十字花科植物當中。研究顯示，PEITC可通過多種機制腫瘤細胞的生長與增殖，如PEITC可與β-微管蛋白結(jié)合，促進微管蛋白的穩(wěn)定而影響細胞有絲分裂[3]。也能抑制去乙酰化酶的活性而影響染色質(zhì)功能[4]。本文旨在觀察PEITC對結(jié)腸癌SW480細胞的遷移與侵襲有何影響，并探討其可能的調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

PEITC購自LKT Laboratories(純度≥95％)，并用二甲基亞砜溶解。細胞培養(yǎng)基為Invitrogen產(chǎn)品，培養(yǎng)板和Transwell小室購自Corning。Trizol試劑購自Invitrogen公司。RT-PCR試劑盒購自大連寶生物。抗MMP-9和β-actin抗體購自Santa Cruz。磷酸化Akt，總Akt抗體購自Cell Signaling。ECL化學發(fā)光試劑盒購自Amersham Pharmacia。NF-κB熒光素酶報告基因購自SABioscicence，雙重熒光素酶實驗系統(tǒng)購自Promega。pGL3-basic載體和DNA轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen。

1.2 細胞培養(yǎng)

SW480細胞株購自中南大學腫瘤研究所，用含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37 ℃，5％ CO2條件下培養(yǎng)。分別設立對照組(加入等體積的二甲基亞砜)及不同濃度PEITC處理組(加入終濃度為10、30、50 μmol/L的PEITC作用24 h)。采用MTT觀察PEITC對SW480細胞的增殖情況，即，SW480孵育結(jié)束后，每孔加入30 μL MTT溶液(1 mg/mL)孵育2 h。棄上清，并加入200 μL二甲基亞砜，充分混勻，用酶標儀測定各孔的吸光度值(OD570)，并計算抑制率。抑制率=(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值×100％。

1.3 RT-PCR檢測MMP-9 mRNA表達

采用Trizol提取RNA，并根據(jù)試劑盒提供的步驟進行逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)。PCR反應條件如下：94 ℃變性30 s，65 ℃(MMP-9)或59 ℃(GAPDH) 30 s，72 ℃延伸30 s。隨后進入40(MMP-9)或35(GAPHD)個擴增循環(huán)。其中MMP-9引物分別為5′-CGCTACCACCTCGAACTTTG-3′和5′-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3′，產(chǎn)物196 bp。GAPDH：5′-TCACCATCTTCCAGGAGCGA-3′，5′-CACAATGCCGAAGTGGTCGT-3′，產(chǎn)物700 bp。擴增產(chǎn)物隨后經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳，并采用Image J軟件進行灰度分析并計算兩者比值。

1.4 劃痕愈合實驗

通過劃痕愈合實驗測定細胞的遷移能力。即，5×106細胞接種于6孔板中37 ℃培養(yǎng)6 h。待細胞呈單層貼壁生長后，用200 μL的移液管尖端在板上劃痕。PBS洗滌后加入含有PEITC的完全培養(yǎng)基孵育24 h。在顯微鏡下拍照并計算遷移率：(1-處理后劃痕距離/對照組劃痕距離)×100％。

1.5 侵襲性實驗

將基質(zhì)膠均勻鋪至Transwell小室上室，并加入100 μL細胞懸液(106/mL)，下室加入500 μL完全培養(yǎng)基，37 ℃孵育24 h。取出Transwell，多聚甲醛固定，風干后加入0.1％結(jié)晶紫染色20 min。擦除上室細胞，顯微鏡下隨機選擇視野拍照，計算遷移到下腔表面的細胞數(shù)。其中侵襲抑制率=(1-樣本穿膜細胞數(shù)/對照組穿膜細胞數(shù))×100％。

1.6 Western blot

根據(jù)試劑盒提供的步驟提細胞總蛋白并測定其濃度。獲取100 μg蛋白用于SDS-PAGE。分離的總蛋白或核蛋白隨后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上(Millipore)，并利用含5％脫脂牛奶的TBST封閉1 h，隨后加入一抗抗體4 ℃孵育過夜。多次洗滌之后，加入HRP標記的二抗孵育膜1 h。ECL法(Amersham)發(fā)光、顯影。

1.7 瞬時轉(zhuǎn)染和熒光素酶報告基因分析

獲取MMP-9基因(基因ID：D10051)上游-720 bp～-11 bp啟動子區(qū)域序列，用PCR克隆至pGL3-basic載體中，構(gòu)建pGL3-MMP-9-luc報告基因質(zhì)粒。SW480細胞接種于6孔板中，當其密度達視野的70％～80％時，共轉(zhuǎn)入0.2 μg pGL3-MMP-9-luc(或NF-κB-luc)報告基因質(zhì)粒以及0.2 μg pSV-β-半乳糖苷酶并培養(yǎng)18 h。隨后細胞加入不同濃度PEITC作用24 h，根據(jù)試劑盒(Promega)提供的操作步驟，采用光測定儀(Turner BioSystems，Luminometer 20/20n)獲取螢光素酶和β-半乳糖苷酶活性。以β-半乳糖苷酶活性為內(nèi)參，計算螢光素酶活性的相對值。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 PEITC抑制SW480細胞的遷移和侵襲

MTT結(jié)果顯示，10～50 μmol/L PEITC處理對細胞的活性無明顯影響(結(jié)果未顯示)。而劃痕愈合實驗顯示，10、30和50 μmol/L PEITC處理SW480細胞后，細胞遷移率分別為(64.27±5.14)％，(51.57±4.39)％和(43.81±3.61)％，與對照組相比，差異均有顯著性。Transwell結(jié)果顯示，不同濃度的PEITC也能呈劑量依賴性方式抑制SW480細胞侵襲(圖1，表1)。

圖1 PEITC抑制SW480細胞遷移和侵襲(×10)

表1 PEITC對SW480細胞的遷移率和侵襲率(％)

2.2 PEITC抑制SW480細胞MMP-9蛋白及mRNA表達

RT-PCR結(jié)果顯示，SW480細胞未處理前，MMP-9 mRNA表達水平較高，經(jīng)不同濃度PEITC處理后，其mRNA水平隨著濃度的增高而降低(圖2A)。Western blot結(jié)果也顯示，10～50 μmol/L PEITC處理后，MMP-9蛋白含量逐漸降低(圖2B)。

2.3 PEITC抑制PI3K/NF-κB通路的活性

Western blot結(jié)果顯示，PEITC處理后，SW480細胞中磷酸化Akt水平明顯降低，而總Akt無明顯影響(圖3A)。此外，報告基因結(jié)果顯示，PEITC也能影響NF-κB-luc的轉(zhuǎn)錄活性，同時，采用20 μmol/L PI3K抑制劑LY294002處理后，NF-κB-luc活性顯著降低(圖3B)。

圖3 PEITC對PI3K/NF-κB活性的影響

2.4 PEITC經(jīng)PI3K/NF-κB抑制MMP-9的表達與轉(zhuǎn)錄

Western blot顯示，PI3K抑制劑LY294002和NF-κB抑制劑PDTC處理SW480細胞后，MMP-9表達顯著降低。此外，報告基因顯示，不同濃度PEITC處理能顯著抑制MMP-9的啟動子活性，從而抑制MMP-9的轉(zhuǎn)錄(圖4A)。

圖4 PEITC對MMP-9表達及轉(zhuǎn)錄活性的影響

3 討 論

對于結(jié)腸癌而言，癌細胞的局部浸潤以及遠處轉(zhuǎn)移是患者治療失敗和死亡的首要原因。癌細胞在浸潤性生長過程中，細胞基質(zhì)的降解是癌細胞從原發(fā)部位脫落，并經(jīng)淋巴結(jié)或血液轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵。而MMP-9在其中發(fā)揮至關(guān)重要作用。因此，預防或抑制癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移在很大程度上可提高癌癥患者的生存率。有研究顯示PEITC能抑制前列腺癌、乳腺癌以及肺癌細胞肺轉(zhuǎn)移[5]，然而，PEITC對結(jié)腸癌的抑制作用尚未完全清楚，本研究證實PEITC在無細胞毒性的濃度范圍內(nèi)能明顯抑制SW480細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移，并能明顯抑制明膠酶活性和MMP-9的表達，這表明PEITC在結(jié)腸癌中通過抑制MMP-9的表達和活性而具有抗侵襲的潛能。

PI3K是一種脂質(zhì)激酶，通過激活Akt(即蛋白激酶B)控制多種生理過程，它通過誘導P21WAF1定位于細胞質(zhì)，并通過滅活前凋亡因子BAD和caspase-9發(fā)揮抗凋亡作用，此外，活化的Akt可通過誘導MMPs的表達而促進癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[6]。研究顯示，MMP-9 mRNA含量與PI3K的活性成正相關(guān)[7]。本研究也證實，PEITC能抑制PI3K產(chǎn)物Akt磷酸化，從而抑制MMP-9的表達。NF-κB是Akt下游通路的重要靶分子。并參與調(diào)控MMP-9的表達，并與炎癥、腫瘤細胞增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[8]。此外，NF-κB在多種腫瘤細胞中持續(xù)激活，并誘導多種抗凋亡蛋白表達而導致化療/放療耐受[9]。因此抑制NF-κB的活性可能有利于提高藥物的療效。本研究結(jié)果顯示，PEITC可有效抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性。由于MMP-9的啟動子區(qū)域存在NF-κB的結(jié)合位點[10]，因此本研究構(gòu)建了MMP-9啟動子序列的報告基因，結(jié)果也證實，PEITC可通過影響PI3K/NF-κB的活性，從而抑制MMP-9的轉(zhuǎn)錄激活作用。

總之，本研究證明PEITC具有抑制SW480細胞浸潤的能力。其機制可能通過抑制PI3K/ NF-κB信號通路的活性而抑制MMP-9表達。由于PEITC來源于可食用天然植物[11]，這無疑為腫瘤的預防和治療提供了重要參考，長期食用PEITC含量豐富的蔬菜可降低腫瘤發(fā)生的風險，此外，PEITC有望成為結(jié)腸癌的重要輔助治療藥物。

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