周 煦 劉 剛

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的損傷可引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(Endoplasmic Reticulum Stress，ERS)，長(zhǎng)期過(guò)強(qiáng)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性細(xì)胞凋亡。此前的研究提示線粒體調(diào)控的細(xì)胞凋亡是石棉引起細(xì)胞凋亡的主要途徑［1］，ERS 介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡是近年新發(fā)現(xiàn)的凋亡途徑，近年ERS 所啟動(dòng)的凋亡途徑以其獨(dú)特的地位受到越來(lái)越多的關(guān)注。由于肺泡上皮細(xì)胞(Alveolar Epithelial Cell，AEC)的凋亡代表了一個(gè)慢性肺間質(zhì)纖維化的早期活動(dòng)，而石棉肺早期的病理變化類似于特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis，IPF)［2-3］，因此我們以AEC 作為研究對(duì)象探討石棉引起AEC 凋亡的具體機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人肺腺癌上皮細(xì)胞株A549 購(gòu)于American Type Culture Collection(ATCC)。DMEM、FBS(GIBCO Invitroge 公司);BIP，IRE-1α，GRP94，BAK，BAX 抗體(Cell Signaling Technology 公司);β-actin(Santa Cruz 公司)。

1.2 儀器

激光共聚焦顯微鏡系統(tǒng)TCS SP5 II(Leica 公司);熒光成像系統(tǒng)VersaDocMP5000(Bio-Rad 公司);生物培養(yǎng)箱Thermofisher144L(Thermo 公司);高速離心機(jī)Minispin(Eppendorf公司);電熱恒溫水箱CU420(Julabo 公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)DMEM 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)培養(yǎng)。

1.3.2 石棉處理 采用不銹鋼剪刀將石棉(產(chǎn)于青海芒崖)纖維狀礦物材料剪碎，PBS 配成5 mg/ml 濃度的懸濁液，經(jīng)超聲分散與充分振蕩混勻，高壓蒸汽滅菌后備用。石棉纖維的分散度大約70%為可吸入(2 ～5 μm)。

1.3.3 免疫熒光染色 甲醛固定細(xì)胞，利用Triton-X-100 使部分膜蛋白變性，羊血清封閉，一抗孵育過(guò)夜，次日沖洗三次，每次10 min，加入二抗，2 h 后沖洗，加入抗熒光淬滅劑后封片，激光共聚焦顯微鏡觀察、采集圖像。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0 軟件進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)。所得數(shù)據(jù)以(±s)表示，組間比較應(yīng)用方差分析及q 檢驗(yàn)。p ＜0.05 認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果

石棉處理A549 細(xì)胞后，ERS 標(biāo)志蛋白Bip、IRE-1α 和GRP94，以及促凋亡基因BAX、BAK 蛋白表達(dá)均上調(diào)，且與石棉暴露時(shí)間呈正相關(guān)。

圖1 石棉暴露下ERS 相關(guān)蛋白和促凋亡基因BAX、BAK 的變化

3 討論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過(guò)激活未折疊蛋白反應(yīng)(Unfolded Protein Response，UPR)以保護(hù)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所引起的細(xì)胞損傷［4］，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)蓄積在網(wǎng)腔內(nèi)的錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)的處理，有利于維持細(xì)胞的正常功能并使之存活，但是如果損傷太過(guò)嚴(yán)重以致內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定不能及時(shí)恢復(fù)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以引起細(xì)胞凋亡，信號(hào)就會(huì)由促生存向促凋亡轉(zhuǎn)換［5-6］。

Bip 是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的重要分子伴侶，與許多內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白都有短暫的相互作用，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的一個(gè)感應(yīng)器，參與調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子內(nèi)穩(wěn)態(tài)等諸多生物學(xué)過(guò)程。結(jié)果顯示:石棉處理A549 細(xì)胞后，通過(guò)檢測(cè)作為ER 穩(wěn)態(tài)感受器以及UPR 標(biāo)志蛋白的Bip(Immunoglobulin Binding Protein，or Glucose Regulating Protein，又稱為GRP78)，免疫印跡結(jié)果顯示該蛋白表達(dá)上調(diào)，且與作用時(shí)間呈正相關(guān)，提示ERS 參與了石棉引起的細(xì)胞凋亡。IRE-1(Inositol-Requiring Enzyme 1)通路是ERS 誘導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的三大通路之一，IRE-1 感受ERS 的過(guò)程與Bip 的游離有關(guān)。當(dāng)ER 穩(wěn)態(tài)失衡，出現(xiàn)大量未折疊蛋白聚集，Bip 與IRE-1 解離，轉(zhuǎn)而與未折疊蛋白結(jié)合，促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊。當(dāng)ERS 反應(yīng)程度過(guò)強(qiáng)或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，損傷超過(guò)修復(fù)能力，IRE -1 可啟動(dòng)凋亡機(jī)制，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。GRP94 作為應(yīng)激蛋白，可能也與細(xì)胞凋亡存在一定的關(guān)系［7］。

長(zhǎng)期以來(lái)，大多研究認(rèn)為AEC 凋亡主要通過(guò)線粒體途徑和死亡受體途徑介導(dǎo)［8-9］，而我們最近的研究發(fā)現(xiàn):石棉暴露下，A549 細(xì)胞(具有AEC 特性)上ERS 標(biāo)志蛋白IRE -1 和GRP94 表達(dá)上調(diào)，進(jìn)一步證實(shí)ERS 途徑參與了石棉引起的細(xì)胞凋亡。我們還發(fā)現(xiàn)A549 細(xì)胞經(jīng)石棉處理后，Bcl -2家族中具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡作用的BAX、BAK［10］的表達(dá)與ERS 相關(guān)蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，已有報(bào)告顯示BAX 和BAK可能通過(guò)與IRE-1α 的直接作用來(lái)調(diào)控UPR［11］。

細(xì)胞凋亡本身具有兩面性，同樣具有兩面性的ERS 引起細(xì)胞凋亡時(shí)，信號(hào)會(huì)由促生存向促凋亡轉(zhuǎn)換，該轉(zhuǎn)換具體通過(guò)什么途徑實(shí)現(xiàn)?石棉暴露下，ERS 誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑的許多方面仍未明確，需要我們更進(jìn)一步的研究闡明該細(xì)胞凋亡途徑的調(diào)控機(jī)制。

［1］ PANDURI V，WEITZMAN S A，CHANDEL N，et al. The mitochondria - regulated death pathway mediates asbestos - induced alveolar epithelial cell apoptosis［J］. American journal of respiratory cell and molecular biology，2003，28(2):241 -248.

［2］ LIU G，BERI R，MUELLER A，et al. Molecular mechanisms of asbestos-induced lung epithelial cell apoptosis［J］. Chemico -Biol Interact，2010，188:309 -318.

［3］ NOBLE PW. Epithelial fibroblast triggering and interactions in pulmonary fibrosis［J］. Eur Respir Rev，2008，17 (109):123 -129.

［4］ MCALPINE C S，BERIAULT D R，BEHDINAN T，et al. Oral glucosamine sulphate supplementation does not induce endoplasmic reticulum stress or activate the unfolded protein response in circulating leukocytes of human subjects［J］. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology，2014，92(4):285 -291.

［5］ CHUNYAN XU，BEATRICE BAILLY - MAITRE，JOHN C.Reed. Endoplasmic reticulum stress:cell life and death decisions［J］. J Clin Invest，2005，115:2656 -2664.

［6］ KEZHONG ZHANG，RANDAL J. KAUFMAN. Signaling the Unfolded Protein Response from the Endoplasmic Reticulum［J］. J Bio Chem，2004，279:25935 -25938.

［7］ LEE A S. Glucose - regulated proteins in cancer:molecular mechanisms and therapeutic potential［J］. Nature Reviews Cancer，2014，14(4):263 -276.

［8］ SNIDER GL，KLEINERMAN LJ，THURLBECK WM，et al. The Definition of Emphysema:Report of a National，Heart，Lung and Blood Institute，Division of Lung Diseases Workshop［J］. Am Rev Respir Dis，1985，132(l):182 -185.

［9］ KUO WH，CHEN JH，LIN HH，et al. Induction of apoptosis in the lung tissue from rats exposed to cigarette smoke involves P38/JNK MAPK pathway［J］. Chemico - Biological Interactions，2005，155:31 -42.

［10］ 許雪梅，譚瑞丹，梁仁強(qiáng)，等.烏司他丁對(duì)缺血再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡及Bcl -2，Bax 表達(dá)的影響［J］. 現(xiàn)代醫(yī)院，2009，9(5):17 -19.

［11］ MA Y，HENDERSHOT L M. The role of the unfolded protein response in tumor development:friend or foe?［J］.Nat Rev Cancer，2004，4:966 -977.