摘要：根據(jù)植物NBS-LRR類抗病基因同源序列（RGA）的保守區(qū)域設(shè)計簡并引物，從甘薯近緣野生種Ipomoea grandifolia中擴增NBS-LRR類RGA，得到7條NBS-LRR類RGA，其編碼的氨基酸序列包含NBS-LRR類RGA所具有的保守的P-loop、Kinase-2和Kinase-3及GLPL區(qū)。用DNAMAN軟件對7個I. grandifolia NBS-LRR類RGA及10個已知物種的NBS-LRR類RGA氨基酸序列進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)其聚為兩類，兩類之間的相似性較低，推測各類中相似性較高的序列分別屬于同一個基因家族。

關(guān)鍵詞：Ipomoea grandifolia；NBS-LRR；抗病基因同源序列（RGA）

中圖分類號：S531 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）11-2680-04

甘薯[Ipomoea batatas（L.） Lam.]是重要的糧食、飼料、工業(yè)原料及新型能源用塊根作物，中國是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國，常年種植面積550萬hm2，鮮薯產(chǎn)量約1.2×108 t，分別占世界甘薯種植總面積和總產(chǎn)量的60%和85%[1]。甘薯在遺傳上高度雜合，種內(nèi)、種間雜交不親和以及遺傳資源匱乏，遺傳基礎(chǔ)狹窄，病蟲害、病毒病危害嚴(yán)重，制約了甘薯品種的遺傳改良[2，3]。

抗病基因同源序列（Resistance gene analog， RGA）是一種存在于植物基因組中具有特定保守結(jié)構(gòu)域的DNA區(qū)段，具有容易獲得、擴增結(jié)果穩(wěn)定和使用成本低等優(yōu)點。以RGA區(qū)段的保守性為基礎(chǔ)設(shè)計PCR特異簡并引物擴增抗病基因同源序列，進而進行抗病基因的分離和克隆已經(jīng)成為當(dāng)前比較流行的克隆植物抗病基因的策略之一[4]。很多甘薯近緣野生種具有抗病蟲、高干率、抗逆等優(yōu)良基因[3]，目前已有關(guān)于從甘薯和甘薯近緣野生種三淺裂野牽牛（I. trifida）中分離出RGA的報道，而有關(guān)從甘薯近緣野生種I. grandifolia中分離抗病基因的研究還未見報道[5-11]。本研究基于植物NBS-LRR類抗病基因的保守區(qū)域設(shè)計簡并引物，獲得甘薯近緣野生種I. grandifolia NBS-LRR類RGA，為甘薯近緣野生種抗病基因的鑒定分離及甘薯品種的遺傳改良研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

甘薯近緣野生種I. grandifolia植株由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)劉慶昌教授惠贈，種植于湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所試驗田，采集新鮮幼嫩葉片用于植物DNA的提取。

1.2 方法

2 結(jié)果與分析

2.2 I. grandifolia NBS-LRR類RGA的氨基酸序列分析

將PCR獲得的甘薯近緣野生種I. grandifolia NBS-LRR類RGA片段委托上海英駿生物技術(shù)有限公司進行序列測定，對測序結(jié)果進行分析，BLAST同源性比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)有7個片段與NCBI中已登錄的植物抗病基因及同源序列具有一定的同源性，可見利用簡并引物進行同源擴增是分離I. grandifolia RGA的有效方法。從結(jié)構(gòu)上看，推導(dǎo)的RGA氨基酸序列均具有P-loop（MGGVGKTT）、Kinase-2（LLVLDDVW）和Kinase-3（GSR/KILVTTR）及GLPL區(qū)（GLPLAL）幾個保守區(qū)（圖2），這是NBS-LRR類基因共有的特征，據(jù)此可確定這7條序列均為NBS-LRR類抗病基因同源序列。比較I. grandifolia和甘薯的NBS-LRR類RGA氨基酸序列，在92的位置上有差異，甘薯為A（丙氨酸）而I. grandifolia為V（纈氨酸）（圖3）。

2.3 I. grandifolia與已知物種NBS-LRR類RGA氨基酸序列的比對分析

將擴增得到的I. grandifolia NBS-LRR類RGA基因序列和數(shù)據(jù)庫中檢索到的10條已知物種的NBS-LRR類RGA基因序列進行同源性比對，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖4。由圖4可知，這些序列聚成兩大類，I. grandifolia的Ig-11、Ig-12、Ig-28、Ig-36、Ig-42、Ig-44與I. batatas的（AAZ07902、ABD33460）、毛果楊（Populus trichocarpa）、蓖麻（Ricinus communis）和馬鈴薯野生種（Solanum bulbocastanum）的抗病相關(guān)基因聚成一大類，其中Ig-11、Ig-12、Ig-28、Ig-36、Ig-42、Ig-44與I. batatas的AAZ07902、ABD33460的同源性為95.29%～98.82%，推測它們來源于同一基因家族。序列Ig-31與甘薯的Ib-ABD33456、三淺裂野牽牛的It-ABH10960、菊芋（Helianthus tuberosus）、甜瓜（Cucumis melo）和夏葡萄（Vitis aestivalis）的抗病相關(guān)基因聚成一大類，序列Ig-31與菊芋抗病相關(guān)基因之間氨基酸序列的同源性為49.11%，可能屬于同一基因家族。

3 討論

同源序列克隆法具有過程相對簡單、適用對象廣泛等優(yōu)點，采用同源序列克隆法已在水稻、甘蔗、結(jié)球甘藍(lán)、柚等多種植物上獲得了RGA，顯示了廣泛的應(yīng)用前景[13-15]，這些RGA有的定位在某些抗病基因附近，為分子標(biāo)記輔助育種提供了可能。本研究利用抗病基因的保守序列設(shè)計簡并引物進行同源擴增，首次從甘薯近緣野生種I. grandifolia中分離出RGA，比較I. grandifolia和甘薯NBS-LRR類RGA的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)兩個物種在第92個氨基酸位置上存在一個氨基酸的差異，該氨基酸的改變可能使I. grandifolia具有更強的抗病抗逆能力，同時該氨基酸可能是甘薯近緣野生種特有類型的抗病基因序列，這些序列的獲得可為進一步分離并克隆甘薯的全長抗病基因奠定基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] 王紅意，翟 紅，王玉萍，等. 30個中國甘薯主栽品種的RAPD指紋圖譜構(gòu)建及遺傳變異分析[J].分子植物育種，2009，7（5）：879-884.

[2] 李 強，劉慶昌，馬代夫.甘薯近緣野生種研究利用現(xiàn)狀及展望[J]. 分子植物育種，2006，4（6S）：105-110.

[3] 曹清河，張 安，李 鵬，等.甘薯近緣野生種的抗病性鑒定與新型種間雜種的獲得[J].植物遺傳資源學(xué)報，2009，10（2）：224-229.

[4] 闕友雄，許莉萍，林劍偉，等. 甘蔗NBS-LRR類抗病基因同源序列的分離與鑒定[J].作物學(xué)報，2009，35（4）：631-639.

[5] 陳觀水，周以飛，林 生，等.甘薯NBS類抗病基因類似物的分離與序列分析[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報，2006，14（5）：359-365.

[6] 林巧玲，曾會才.甘薯中NBS—LRR類抗病基因同源序列的克隆及序列分析[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2007，16（2）：65-69.

[7] CHEN G S， PAN D R， ZHOU Y F， et al. Diversity and evolutionary relationship of nucleotide binding site-encoding disease-resistance gene analogues in sweet potato（Ipomoea batatas Lam.）[J]. Journal of Biosciences，2007，32（4）：713-721.

[8] 陳觀水，潘大仁，周以飛，等. 三淺裂野牽牛NBS類抗病基因同源序列的克隆與分析[J]. 西北植物學(xué)報，2007，27（9）：1728-1734.

[9] 王 鈺，王榮富，何國浩.甘薯抗病基因同源序列的克隆與分析[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，31（3）：81-86.

[10] LIN Q L， ZENG H C. Cloning and analysis of NBS-LRR type resistance gene analogues in sweet potato （Ipomoea batatas）[J]. Agricultural Science and Technology，2008，9（2）：76-80.

[11] WANG Y， ROSEN B， SCOFFIELD J， et al. Isolation and analysis of resistance gene homologues in sweetpotato[J]. Plant Breeding， 2009，129（5）：519-525.

[12] CORDERO J， SKINNER D. Isolation from alfalfa of resistance gene analogues containing nucleotide binding sites[J]. TAG Theoretical and Applied Genetics，2002，104（8）：1283-1289.

[13] 鄭先武，翟文學(xué)，李曉兵，等.水稻NBS-LRR類R基因同源序列[J]. 中國科學(xué)：C輯，2001，31（1）：43-51.

[14] 曹必好，雷建軍，夏 勇，等.結(jié)球甘藍(lán)NBS-LRR類R基因同源序列的分離[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，37（7）：1081-1084.

[15] 黃代青，王 平，呂柳新.柚cDNA中NBS-LRR類R基因同源序列的分離[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，37（10）：1580-1584.