摘要：對(duì)植物基因組數(shù)據(jù)庫和過氧化物酶數(shù)據(jù)庫中玉米谷胱甘肽過氧化物酶（Zea mays Glutathione peroxidase，ZmGPXs）進(jìn)行查找和比對(duì)，確定了6個(gè)ZmGPXs，采用生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行了理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、結(jié)構(gòu)域、高級(jí)結(jié)構(gòu)、外顯子和內(nèi)含子構(gòu)成等分析。結(jié)果表明，盡管6個(gè)ZmGPXs序列的氨基酸數(shù)量不同，但均屬于堿性蛋白質(zhì)，具有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，其中5個(gè)ZmGPXs高級(jí)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為二聚體，具有植物GPXs的特征基序。亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)ZmGPXs主要定位于線粒體、葉綠體、過氧化物酶體和細(xì)胞質(zhì)中。結(jié)構(gòu)域分析表明ZmGPXs屬于硫氧還蛋白超家族。

關(guān)鍵詞：谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPX）；玉米（Zea mays）；生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)：Q554+6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）11-2675-05

1 方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

數(shù)據(jù)資料來源于植物基因組數(shù)據(jù)庫（Phytozome，http：//www.phytozome.net）和過氧化物酶數(shù)據(jù)庫（PeroxiBase，http：//peroxibase.toulouse.inra.fr/），從中獲得ZmGPXs的基因序列和氨基酸序列。

1.2 方法

利用DNAMAN軟件對(duì)所獲得的氨基酸序列進(jìn)行序列比對(duì)和理化性質(zhì)分析，其保守結(jié)構(gòu)域、磷酸化修飾、跨膜結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位和高級(jí)結(jié)構(gòu)分別采用NCBI protein blast（http：//blast. ncbi. nlm. nih.gov/）、NetPhos 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）、TMHMM2.0 Server（http：//www. cbs. dtu. dk / services / TMHMM-2.0）、PSORT（http：// psort. hgc. jp / form. html）和SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）在線工具分析，利用MEGA 5.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ZmGPXs檢索分析結(jié)果

經(jīng)過檢索，在植物基因組數(shù)據(jù)庫（Phytozome）中共獲得7個(gè)編碼玉米GPXs的基因序列（ZmGPXs），注冊(cè)號(hào)分別為ZM2G011025、ZM2G013299、ZM2G12479、 ZM2G135893、 ZM2G144153、ZM2G329144和ZM5G884600。在過氧化物酶數(shù)據(jù)庫（PeroxiBase）中也獲得了7個(gè)ZmGPXs序列，其名稱分別為ZmGPX01、ZmGPX02、ZmGPX03、ZmGPX04、ZmGPX01-2、ZmGPX01-3和ZmGPX03-2。采用DNAMAN軟件和NCBI protein blast對(duì)來源于2個(gè)數(shù)據(jù)庫中的玉米GPXs序列進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，在基因組數(shù)據(jù)庫所獲得的ZmGPXs序列中的ZM2G144153、 ZM2G329144、 ZM2G135893、ZM2G12479和ZM2G013299等5個(gè)序列編碼的氨基酸序列分別與PeroxiBase中的ZmGPX01、ZmGPX02、ZmGPX03、ZmGPX04和ZmGPX03-2同源性達(dá)到100%，ZM2G013299與ZmGPX01-3同源性為98%，ZM5G884600與ZmGPX01-2同源性為95%。ZM2G011025沒有獲得較高的同源性分析結(jié)果。根據(jù)上述比對(duì)分析結(jié)果，玉米基因組中推測(cè)的7個(gè)編碼ZmGPXs的序列中有6個(gè)可以確定，參考PeroxiBase的命名，分別為ZmGPX01、ZmGPX02、ZmGPX03、ZmGPX04、ZmGPX03-2和ZmGPX01-2，另外1個(gè)（ZM2G011025）尚不能確定。

2.2 ZmGPXs的理化性質(zhì)

對(duì)經(jīng)過比對(duì)分析確定的6個(gè)ZmGPXs氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果見表1。由表1可知，6個(gè)ZmGPXs中氨基酸數(shù)量最少為166，最多為246；分子量最小是18.347 ku，最大為26.811 ku。ZmGPXs的等電點(diǎn)（pI）介于7.04～10.06之間，其中ZmGPX04的等電點(diǎn)為10.06。用TMHMM 2.0 Server在線軟件分別對(duì)6個(gè)ZmGPXs的氨基酸序列進(jìn)行分析，所有肽鏈跨膜結(jié)構(gòu)域的可能性均為0，說明ZmGPXs序列不存在跨膜結(jié)構(gòu)，不是跨膜蛋白。

2.3 ZmGPXs磷酸化修飾位點(diǎn)與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

用NetPhos 2.0 Server分別對(duì)6個(gè)ZmGPXs的氨基酸序列進(jìn)行潛在磷酸化位點(diǎn)分析，比較6個(gè)ZmGPXs所具有的潛在磷酸化位點(diǎn)總數(shù)，可見ZmGPX03的磷酸化位點(diǎn)數(shù)最高，為18，其次為ZmGPX01和ZmGPX01-2，分別為15和14，而ZmGPX02具有的磷酸化位點(diǎn)數(shù)最少，為7。

GPXs功能的發(fā)揮與其亞細(xì)胞定位有關(guān)，使用PSORT在線工具對(duì)6個(gè)ZmGPXs進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析。結(jié)果顯示，6個(gè)ZmGPXs主要定位于細(xì)胞質(zhì)、線粒體、葉綠體和過氧化物酶體中，除ZmGPX03-2外，其他5個(gè)ZmGPXs皆分布于線粒體中；ZmGPX01、ZmGPX02、ZmGPX03和ZmGPX03-2分布于過氧化物酶體中；而ZmGPX01、ZmGPX04、ZmGPX03-2和ZmGPX01-2分布于葉綠體中；此外ZmGPX02還被定位于質(zhì)膜上。

2.4 ZmGPXs結(jié)構(gòu)域特征

采用NCBI protein blast對(duì)6個(gè)ZmGPXs進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域（Conserved domains）在線分析，結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，盡管6個(gè)序列的氨基酸數(shù)量不同，但具有相同的特征：都屬于硫氧還蛋白超家族（Thioredoxin-like superfamily）以及谷胱甘肽過氧化物酶，都具有3個(gè)催化殘基位點(diǎn)和二聚體界面。

利用DNAMAN對(duì)6個(gè)ZmGPXs進(jìn)行多序列比對(duì)分析（圖2）。結(jié)果顯示，6個(gè)序列都具有3個(gè)保守性較高的結(jié)構(gòu)域：KVLLINVAS、FEILAFPCNQF和KWNFSKFLVD，皆為GPXs的特征基序；具有3個(gè)保守的催化殘基，即C、Q和W。因此6個(gè)序列都屬于GPXs家族成員。此外，6個(gè)序列都具有3個(gè)半胱氨酸殘基（C），該位點(diǎn)在動(dòng)物的PHGPXs中為硒代半胱氨酸殘基。

2.5 ZmGPXs的外顯子和內(nèi)含子構(gòu)成

利用植物基因組數(shù)據(jù)庫對(duì)編碼ZmGPXs的基因序列ORF（Open reading frame）的外顯子和內(nèi)含子的構(gòu)成進(jìn)行分析。結(jié)果顯示ZmGPXs的ORF區(qū)均由6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)符合真核生物GT-AG規(guī)則，外顯子的長度具有高度保守性，內(nèi)含子的長度差異較大。每個(gè)基因的第2個(gè)至第5個(gè)外顯子的長度分別是77 bp、62 bp左右、119 bp、168 bp左右。第1個(gè)外顯子長度差異較大，ZmGPX03和ZmGPX04第1個(gè)外顯子的長度大于200 bp，其他序列的第1個(gè)外顯子的長度介于39～54 bp之間。除ZmGPX01的第6個(gè)外顯子長度為89 bp外，其他5個(gè)ZmGPXs的第6個(gè)外顯子的長度介于30～36 bp之間。將ZmGPXs序列的3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（即GPXs特征基序）與基因序列比對(duì)分析，顯示3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域（KVLLINVAS、FEILAFPCNQF和KWNFSKFLVD）分別對(duì)應(yīng)在第2和3個(gè)、第4個(gè)、第5個(gè)外顯子上，并且位置相對(duì)保守（圖3）。

2.6 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用MEGA 5.0構(gòu)建ZmGPXs家族的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖4）以及ZmGPXs家族與AtGPXs家族的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖5）。圖4顯示6個(gè)ZmGPXs可聚分為兩類，一類包括4個(gè)（ZmGPX01、ZmGPX01-2、ZmGPX02和ZmGPX03-2），另一類包括2個(gè)（ZmGPX03和ZmGPX04）。

比較6個(gè)ZmGPXs和8個(gè)AtGPXs在進(jìn)化上的關(guān)系，除了AtGPX4與ZmGPX02、AtGPX6與ZmGPX04同源性較高外，總體上ZmGPXs與AtGPXs的同源性較低。

2.7 高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

同一段氨基酸序列因?yàn)榫哂胁煌母呒?jí)折疊結(jié)構(gòu)而具有不同的生物功能，因此預(yù)測(cè)基因的蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)于研究基因的功能有重要的意義。利用SWISS-MODEL對(duì)ZmGPXs的高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，如圖6所示。結(jié)合圖6以及表2中的統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，除ZmGPX02為單體形式（5個(gè)α-螺旋、6個(gè)β-折疊片與一些轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲相互連接而形成）外，其他5個(gè)ZmGPXs的三維結(jié)構(gòu)均為二聚體結(jié)構(gòu)，基本由12個(gè)α-螺旋、8～12個(gè)β-折疊片與一些轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲相互連接而形成，此外，ZmGPX02的折疊結(jié)構(gòu)與其他ZmGPXs的二聚體中單體的折疊結(jié)構(gòu)也存在明顯差異。說明兩種結(jié)構(gòu)類型的ZmGPXs發(fā)揮功能的方式可能不同。

3 小結(jié)與討論

根據(jù)兩個(gè)數(shù)據(jù)庫的比對(duì)分析，獲得了編碼ZmGPXs的6個(gè)基因序列，分別位于2號(hào)和5號(hào)染色體上，其蛋白質(zhì)分子量為18.347～26.811 ku，均不存在跨膜結(jié)構(gòu)域。ZmGPX03、ZmGPX01和ZmGPX01-2的磷酸化位點(diǎn)較多。一般來說，多肽鏈中的氨基酸潛在的磷酸化位點(diǎn)越多，發(fā)揮更多功能的可能性就越大。

對(duì)ZmGPXs進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)的結(jié)果表明，6個(gè)ZmGPXs主要定位于線粒體、葉綠體、過氧化物酶體和細(xì)胞質(zhì)中，其中ZmGPX04和ZmGPX01-2均在線粒體和葉綠體中分布，ZmGPX01、ZmGPX03和ZmGPX03-2在線粒體、葉綠體和過氧化物酶體上均有分布。蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位與其功能相關(guān)，上述亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析結(jié)果提示GPXs發(fā)揮作用的位點(diǎn)與產(chǎn)生活性氧的部位有關(guān)。

對(duì)ZmGPXs結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果顯示，6個(gè)ZmGPXs均具有3個(gè)催化殘基和二聚體界面。ZmGPX03和ZmGPX04與其他4個(gè)ZmGPXs相比多約70個(gè)氨基酸，但是催化殘基和二聚體界面距離C端較近，說明GPXs功能發(fā)揮的位點(diǎn)靠近C端，而N端序列可能主要與蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位有關(guān)。

GPXs的3個(gè)標(biāo)志性基序（KVLLINVAS、FEILAFPCNQF和KWNFSKFLVD）在6個(gè)ZmGPXs中高度保守，且這些特征基序在擬南芥AtGPXs中也具有較高的保守性，說明在植物進(jìn)化過程中，GPXs的特征基序在其執(zhí)行功能時(shí)發(fā)揮著重要的作用，保守性很強(qiáng)。

ZmGPXs基因序列具有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子，其中保守結(jié)構(gòu)域所對(duì)應(yīng)的外顯子（第2～5個(gè)）長度保守性較強(qiáng)，第1個(gè)和第6個(gè)外顯子長度變化較大，內(nèi)含子的長度差異明顯，這種特點(diǎn)也體現(xiàn)在8個(gè)AtGPXs中。編碼GPXs的基因序列在不同物種的基因組中高度保守，原因可能是保守的外顯子序列是植物GPXs行使功能必需的序列。差異外顯子序列主要表現(xiàn)在第1個(gè)和第6個(gè)外顯子，可能與行使其特有功能有關(guān)。內(nèi)含子的差異可能是不同基因存在的不同調(diào)控機(jī)制，同時(shí)也體現(xiàn)了進(jìn)化變異的特點(diǎn)。

雖然結(jié)構(gòu)域分析顯示6個(gè)ZmGPXs都具有二聚體界面，但是ZmGPXs編碼的蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示6個(gè)ZmGPXs在作用形式上分為兩類，一類以單體形式存在（ZmGPX02），一類以二聚體形式存在，說明ZmGPXs可能以二聚體形式發(fā)揮功能，也可能以單體的形式發(fā)揮作用。

從進(jìn)化關(guān)系上看，ZmGPXs與AtGPXs的同源性較低。但是ZmGPXs與AtGPXs在結(jié)構(gòu)域上的高度保守性提示植物GPXs進(jìn)化過程中保留了其基本的催化功能，而ZmGPXs與AtGPXs在序列與結(jié)構(gòu)上的差異顯示在不同植物物種中GPXs具有一定的差異。

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