摘要：利用光學顯微鏡和電子顯微鏡對利瑪原甲藻（Procentrum lima）形態(tài)特征及生活史進行了觀察。結果表明，其細胞呈卵圓形，長33～44 μm，寬23～33 μm，殼孔62～87個，邊緣刺胞孔52～68個。同時，對其生活周期及生殖方式進行了追蹤觀察，不同的生活周期存在著不同的細胞形態(tài)。二分裂是利瑪原甲藻主要的分裂方式，并首次發(fā)現利瑪原甲藻疑似橫分裂、出芽生殖的生殖方式。利瑪原甲藻面對不良環(huán)境時會形成薄壁囊胞。

關鍵詞：利瑪原甲藻（Procentrum lima）；形態(tài)特征；生活史；無性生殖；有性生殖

中圖分類號：P745；S917.3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）11-2607-05

利瑪原甲藻（Procentrum lima）是一種能產生毒素的底棲附生甲藻，分布于熱帶和溫帶沿海水域，是構成海洋生態(tài)系統(tǒng)的基礎，是浮游動物的食物來源[1-5]。利瑪原甲藻具有特殊的生理機制，能產生一系列的次生代謝產物，如腹瀉性貝毒。該毒素被魚、蝦、貝攝食后在其體內積累，并通過食物鏈傳遞至人類，引起腹瀉性中毒。腹瀉性貝類中毒現象普遍存在，已被列為世界食品衛(wèi)生學重要問題之一，并引起世界上許多國家及相關國際組織高度重視。除了帶來食品安全隱患外，腹瀉性貝毒還具有抑制蛋白磷酸酶活性、遺傳毒性、促癌活性、促瘤活性、抑癌和抗瘤活性、藥理活性等特性[6-9]。

目前，對利瑪原甲藻形態(tài)、生長、生理、產物化學結構等方面有許多研究[1-5，10-17]。然而，有關利瑪原甲藻生活史及其環(huán)境關系方面的研究還未見報道。球狀棕囊藻生活史中共有4種不同類型的單細胞，不同的細胞能夠適應不同的環(huán)境，占據不同的生態(tài)位，有利于棕囊藻細胞的生長[18]。孢囊是藻類處于不良環(huán)境時形成的一種細胞形態(tài)，被認為是赤潮發(fā)生的“種源”之一[19，20]，對赤潮的發(fā)生、延續(xù)和消亡過程有著重要的作用。利瑪原甲藻是否亦存在多種細胞類型？這些不同類型的細胞與環(huán)境存在什么聯系？利瑪原甲藻是否也能形成孢囊，作為形成赤潮的潛在因素？本研究對利瑪原甲藻生活史進行了觀察，為進一步研究利瑪原甲藻與環(huán)境的關系打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

利瑪原甲藻采自海南省三亞市，經分離純化后，保存于中國科學院南海海洋研究所廣東省海洋藥物重點實驗室保種室。利瑪原甲藻在溫度30 ℃、鹽度35‰、光照強度3 500 lx、光照周期13 h∶11 h的環(huán)境條件下采用改良K培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2 形態(tài)觀察

1.2.1 光學顯微鏡觀察 吸取利瑪原甲藻培養(yǎng)液至Nikon-TS100倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.2 電子顯微鏡觀察 取20 mL利瑪原甲藻培養(yǎng)液，加入4%甲醛固定24 h，800 r/min離心5 min后棄上清；加入ddH2O洗滌后，800 r/min離心5 min后棄上清以去鹽；加入2 mL 50%鋨酸固定4～6 h；800 r/min離心5 min后棄上清，加ddH2O再洗滌，重復3次以去除鋨酸。離心后的沉淀物分別進行乙醇梯度（30%、50%、70%、90%、95%）脫水處理。保持濕潤狀態(tài)進行電鏡前處理，加入適量乙酸異戊酯置換乙醇，然后用液體CO2進行常規(guī)干燥。干燥后輕柔抖動濾紙，使藻末散落至膠膜上，HITACHI E-1010型離子濺射儀噴鍍金膜，用HITACHI S-3400N掃描電鏡觀察并攝影。

1.3 生活周期及生殖方式觀察

將藻株接種至新鮮培養(yǎng)基中，培養(yǎng)方法按照“1.1”方法，每天定時取樣觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 光學顯微鏡及電子顯微鏡下利瑪原甲藻的形態(tài)

利瑪原甲藻在光學顯微鏡下呈黃綠色、卵圓形，細胞中央的淀粉核清晰可見，周圍散布著顆粒狀的淀粉粒和葉綠體（圖1a）。淀粉核與頂孔之間可見大液泡（圖1b），指數生長初期大液泡尤為明顯。細胞內容物外泄后形成空殼（圖1c），殼板上刺胞孔隱約可見，邊緣刺胞孔繞細胞外圍整齊排列。利瑪原甲藻由左、右兩個殼板組成（圖1d），殼板厚而光滑，表面分布著殼孔。邊緣刺胞孔均勻分布在殼板的四周，邊緣刺胞孔是利瑪原甲藻區(qū)別于其他原甲藻的重要特征。殼板連接至邊緣刺胞孔處表面光滑，無殼孔分布（圖1e、1i）。右殼板頂端的V形凹陷是其明顯的標志（圖1f）。V形頂孔由8個小板、1個較大的鞭毛孔及1個較小的輔孔組成（圖1g），兩根鞭毛由鞭毛孔處伸出，突起的鞭毛骨架包圍著輔孔，頂孔至殼板中央的中軸稍有凹陷，殼板中央無刺胞孔。左殼板與右殼板不同，在頂端無V形凹陷，只有個扁平的頂脊區(qū)與鞭毛孔相連，中軸處未下凹，其中央的一小片區(qū)域也沒有刺胞孔的分布（圖1h）。利瑪原甲藻側面圖呈扁圓形，細胞長33～44 μm，寬23～33 μm，殼孔62～87個，邊緣刺胞孔52～68個。

2.2 利瑪原甲藻的生活周期

指數生長期的利瑪原甲藻液泡特別明顯（圖2a），與穩(wěn)定期的利瑪原甲藻相比，絕大部分的細胞有既大又亮的液泡，而且常常不止1個。由于液泡是物質的存儲場所，在指數生長初期，細胞內合成的各種為分裂所準備的物質大多存儲在液泡內，使得此時的液泡既大又亮。指數生長初期亦可見某些細胞底部膨大，呈梨狀，染色體所在位置顏色明顯加深（圖2b）。當利瑪原甲藻到達穩(wěn)定期時，由于營養(yǎng)匱乏，有的細胞會發(fā)生殼壁分離，處于休眠狀態(tài)（圖2c）；也有的細胞會發(fā)生內容物外泄（圖2d）。內容物外泄后的細胞顏色變淡或無色（圖2e），左右殼板會發(fā)生分裂（圖2f）。此外，在穩(wěn)定期常?？吹?對細胞被包裹在透明的囊膜里（圖2g），這是為了適應不良環(huán)境而形成的，穩(wěn)定期水體中的營養(yǎng)成分不足以維持新生細胞的生長需要。生長末期，細胞顏色變深，形狀變得不規(guī)則，淀粉核消失，邊緣刺孢孔變得不明顯（圖2h、2i）。

剛接種時（延滯期），大多數細胞緊貼在瓶底，只有極少的細胞連接形成絮狀懸?。▓D3a）。幾天后（指數生長前期）貼在瓶底的細胞逐漸適應新環(huán)境，部分細胞開始連接在一起，呈懸浮狀，由于生長較活躍，會有一些小氣泡（圖3b）。細胞貼底現象消失，利瑪原甲藻在搖動后形成絲狀或片狀懸浮，并有很多氣泡（圖3c）。因此，液泡和氣泡與利瑪原甲藻的細胞分裂密切相關，可作為觀察利瑪原甲藻生長活躍的標志。穩(wěn)定期時懸浮細胞減少，絕大部分沉底，沒有氣泡（圖3d）。

2.3 利瑪原甲藻的生殖方式

利瑪原甲藻既可無性繁殖又可有性生殖，無性繁殖以二分裂為主，也會出現疑似橫分裂和出芽生殖的生殖形式。

1）利瑪原甲藻的二分裂先是進行核分裂，然后進行質分裂。分裂時，兩個殼板之間的中間帶變寬（圖4a），細胞底部出現分叉（圖4b），呈“V”形。每個子細胞在分裂過程中均合成1個新殼板，即每個細胞均有1塊來自原母細胞的殼板和1塊新合成的殼板。當兩個子細胞還沒分裂完全時，第三個細胞在兩個子細胞之間開始形成“爪”形的三胞體（圖4c）。頂部鞭毛和游動細胞的出現標志著分裂完成。

2）利瑪原甲藻培養(yǎng)過程中，發(fā)現疑似橫分裂的生殖方式。首先是細胞橫軸的一端出現凹陷，此時淀粉核消失（圖4d），然后另一端也發(fā)生凹陷，在細胞底部形成一片顏色較暗的物質（圖4e），接著在細胞上、下部分的中央形成兩個新的淀粉核（圖4f），最后細胞的鞭毛孔與底部處分開（圖4g），在將要分離的連接處可看到透明的薄膜。利瑪原甲藻疑似出芽生殖的現象首次被發(fā)現，小芽孢出自母體接近細胞核的底端，處于母細胞中央的淀粉核清晰可見（圖4h、4i）。

3）利瑪原甲藻的有性生殖是同配生殖。配子外壁脫落后比正常細胞略小，通過受精橋進行固定（圖4j），當配子固定后受精橋消失，細胞核從供體轉移到受體細胞，接著形成大合子（圖4k），該過程與Faust[21]的報道一致。休眠細胞處于合子的旁邊，呈圓形，約為合子的1/3～1/2，邊緣刺胞孔消失，外壁明顯變厚。合子的休眠期很短，當原生質出現，合子開始脫孢囊，形成葉綠素，然后胞質分裂（圖4l）。

3 小結與討論

1）利瑪原甲藻整個生活周期存在游離的單細胞和群體細胞兩種生活形態(tài)。在剛接種的生長初期，密度小、游動的單細胞占優(yōu)勢；到了指數生長期，絕大部分的細胞連接在一起形成絲狀或絮狀懸浮，群體細胞占了絕對優(yōu)勢；穩(wěn)定期后期，細胞沉在底部，有游離的單細胞，也有被絮狀物黏在一起的群體細胞。利瑪原甲藻體積較大，大多數單細胞只能沉在底部緩慢游動，影響光吸收，而細胞連接成絲或絮狀懸浮在培養(yǎng)液中，大大有利于光合作用。因而懸浮的細胞群體常常伴隨有較多較大的氣泡。

2）利瑪原甲藻的生殖方式較為復雜，在生長前期營養(yǎng)良好的環(huán)境條件下以無性繁殖為主，在生長后期營養(yǎng)較匱乏時可觀察到有性繁殖。不同藻類主要生殖方式不同，有性生殖是球狀棕囊藻主要的生殖方式[18]，而利瑪原甲藻主要生殖方式是無性生殖。有毒赤潮藻種（Pfiesteria piscicida）無性生殖的分裂發(fā)生在孢囊里，并非由游動細胞直接分裂而來[22]，擬膝溝亞歷山大藻（Alexandrium pseudogonyaulax）也可以形成暫時性孢囊進行分裂[23]。利瑪原甲藻無性生殖方式有發(fā)生在暫時性孢囊里的分裂，也有由游動細胞直接產生子細胞的分裂。

3）目前，對甲藻生活史研究較多的是孢囊。甲藻孢囊的形成有利于營養(yǎng)細胞在不良環(huán)境下度過逆境階段，而且比營養(yǎng)細胞和休眠細胞更有利于抵御浮游動物的捕食， 甚至隨浮游動物的糞便排出后仍可萌發(fā)，這些現象對于赤潮的引發(fā)、種群的保存、延續(xù)以及分布擴散等均具有重要的生物學和生態(tài)學意義[24，25]。孢囊形成一般認為受營養(yǎng)鹽和溫度兩方面因素的影響。野外采集觀察發(fā)現孢囊形成常是由于溫度降低所誘導，低氮營養(yǎng)可誘導孢囊形成已被室內培養(yǎng)所證實[26-28]。本研究中利瑪原甲藻恒溫培養(yǎng)，孢囊是在生長穩(wěn)定期或者末期被觀察到，因此，其孢囊的形成與營養(yǎng)鹽的缺乏密切相關。

本研究對利瑪原甲藻生活史展開追蹤和觀察，較為全面地觀測和記錄到其生活形態(tài)和生殖方式。多個細胞裹在一個孢囊的繁殖方式或許能加快種群的繁殖速度。首次發(fā)現疑似橫分裂、出芽生殖這些獨特的生殖方式和休眠細胞，豐富了細胞形態(tài)學和利瑪原甲藻生活史的研究。

參考文獻：

[1] BRAVO I，FEMANDEZ M L，RAMILO I，et al. Toxin composition of the toxic dinoflagellate Prorocentrum lima isolated from different locations along the Galician coast（NW Spain）[J]. Toxicon，2001，39（10）：1537-1545.

[2] FAUST M A. Morphology of ciguatera-causing Prorocentrum lima （Pyrrophyta） from widely differing sites[J]. Journal of Phycology，1991，27（5）：642-648.

[3] CARLSON R D，TINDALL D R. Distribution and periodicity of toxic dinoflagellates in the Virgin Islands[A]. ANDERSON D M，WHITE A W，BADEN D G. Toxic Dinoflagellates[M]. New York：Academic Press，1985.171-176.

[4] MARANDA L，CORWIN S，HARGRAVES P E. Prorocentrum lima（Dinophyceae） in northeastern USA coastal waters I： Abundance and distribution[J]. Harmful Algae，2007，6（5）：623-631.

[5] MARANDA L， CORWIN S， DOVER S. Prorocentrum lima （Dinophyceae） in northeastern USA coastal waters II： Toxin load in the epibiota and in shellfish[J]. Harmful Algae，2007， 6（5）：632-641.

[6] COHEN P，HOLMES C F，TSUKITANI Y. Okadaic acid： a new probe for the study of cellular regulation[J]. Trends in Biochemical Sciences， 1990，15（3）：98-102.

[7] FESSARD V， GROSSE Y， PFOHL-LESZKOWICZ A，et al. Okadaic acid treatment induces DNA adduct formation in BHK21 C13 fibroblasts and HESV keratinocytes[J]. Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects，1996，361（2-3）：133-141.

[8] FUJIKI H，SUGANUMA M. Unique features of the okadaic acid activity class of tumor promoters[J]. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology，1999，125（3-4）：150-155.

[9] 陳 洋. DSP等赤潮藻毒素對哺乳類細胞的毒性效應及機制研究[D]. 山東青島：中國科學院海洋研究所，2008.

[10] 徐 杏. 關鍵環(huán)境因子對利瑪原甲藻的生長和產毒影響的研究[D]. 山東青島：中國海洋大學，2009.

[11] 曾 玲，龍麗娟，龍 超. 光照周期、溫度和起始密度對利瑪原甲藻（三亞株）生長的影響[J]. 熱帶海洋學報，2010，29（6）：137-142.

[12] 曾 玲，何偉宏，龍 超，等. 環(huán)境因子對利瑪原甲藻（Prorocentrum lima）產毒影響的初步研究[J]. 中國海洋藥物，2010， 29（6）：21-28.

[13] 邱德全，林永水，周近明，等. 利瑪原甲藻腹瀉毒素的生物學測定[J]. 熱帶海洋，1996，15（4）：46-49.

[14] 吳建欣. 利瑪原甲藻的黑海綿酸釋放與提純最佳化研究[D]. 臺北：國立臺灣大學生命科學院漁業(yè)科學研究所，2007.

[15] 吳 軍，林永水，劉寧寧. Prorocentrum lima的生長特性研究[A]. 中國科學院南海海洋研究所南海實驗站.熱帶海洋研究（五）[M]. 北京：海洋出版社，1997.9-16.

[16] 楊維東，鐘 娜，劉潔生，等. 不同磷源及濃度對利瑪原甲藻生長和產毒的影響研究[J]. 環(huán)境科學，2008，29（10）：2760-2765.

[17] 鐘 娜，楊維東，劉潔生，等.不同氮源對利瑪原甲藻（Prorocentrum lima）生長和產毒的影響[J].環(huán)境科學學報，2008，28（6）：1186-1191.

[18] 王宗靈，黎 慧，高春雷. 球狀棕囊藻的形態(tài)結構、生活史及生態(tài)意義研究進展[J]. 生態(tài)科學，2009，28（1）：90-96.

[19] DALE B. Dinoflagellate Resting Cysts： Benthic Plankton[M]. Cambridge：Cambridge University Press，1983.69-136.

[20] 黃海燕，陸斗定.甲藻孢囊研究進展[J]. 海洋學研究，2009， 27（3）：85-92.

[21] FAUST M A. Alternate asexual reproduction of Prorocentrum lima in culture[A]. SMAYDA T J，SHIMIZU Y. Toxic Phytoplankton Blooms in the Sea[M]. New York：Academic Press，1993.115-126.

[22] LITAKER R W，VANDERSEA M W，KIBLER S R. Life cycle of the heterotrophic dinoflagellate Pfiesteria Piscicida（dinophyceae）[J]. Journal of Phycology，2002，38（3）：442-463.

[23] MONTRESOR M. The life history of Alexandrium pseudogonyaulax（Gonyaulacales，Dinophyceae）[J]. Phycology，1995， 34（6）：444-448.

[24] 鄭 磊，齊雨藻.赤潮甲藻孢囊研究綜述[J]. 暨南大學學報（自然科學版），1995，16（1）：137-149.

[25] BINER B J，ANDERSON D M. Physiological and environmental control of germination in Scrippsie trochoidea（Dinophyceae） resting cysts[J]. Journal of Phycology，1987，23（2）：99-107.

[26] CHEN C P， SUN L， GAO Y H， et al. Seasonal changes of viable diatom resting stages in bottom sediments of Xiamen Bay，China[J]. Journal of Sea Research，2009，61（3）：125-132.

[27] ANDERSON D M，AUBREY D G，TYLER M A. Vertical and horizontal distributions of dinoflagellate cysts in sediments[J]. Limnology Oceanography，1982，27（4）：757-765.

[28] 孫 琳，高亞輝，陳長平，等.氮、硅限制對赤潮藻扁面角毛藻休眠孢子形成的影響[J]. 植物學報，2009，44（5）：601-607.