摘要：采用反復(fù)硅膠柱色譜法、Sephadex LH-20凝膠色譜法等分離純化南海紅樹林內(nèi)生真菌GX-3的代謝產(chǎn)物，并通過理化常數(shù)測(cè)定和光譜分析鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，從南海紅樹林內(nèi)生真菌GX-3的菌體中分離得到6個(gè)代謝產(chǎn)物。經(jīng)波譜解析，分別為：環(huán)（苯丙-甘）二肽（1）、環(huán)（丙-亮）二肽（2）、Fusaric acid （3）、3，6-di-sec-butyl-1，4-dihydroxypiperazine-2，5-dione（4）、環(huán)（脯-亮）二肽（5）、環(huán)（甘-亮）二肽（6）。初步藥理活性顯示化合物1對(duì)口腔癌細(xì)胞KB、KBv200的抗腫瘤活性的LD50值分別為6.5和11.2 μmol/L。通過鑒定，所有化合物均系首次從南海紅樹林內(nèi)生真菌GX-3中分離得到。

關(guān)鍵詞：紅樹林；內(nèi)生真菌；代謝產(chǎn)物

中圖分類號(hào)：O629 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）11-2558-04

海洋微生物資源由于具有可持續(xù)開發(fā)性，其活性物質(zhì)生產(chǎn)不受天然資源難再生的限制，能通過發(fā)酵進(jìn)行胞外生產(chǎn)，與現(xiàn)代微生物技術(shù)相結(jié)合，較容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，特別是其生產(chǎn)不對(duì)環(huán)境造成危害，符合當(dāng)今綠色化學(xué)發(fā)展的方向。而多數(shù)報(bào)道均顯示海洋真菌都與紅樹林有著緊密的聯(lián)系[1，2]，對(duì)紅樹林真菌生物活性物質(zhì)的研究已成為海洋微生物資源開發(fā)利用，尋找天然藥物先導(dǎo)化合物的重要途徑。近十幾年來，已有學(xué)者對(duì)中國南海紅樹林內(nèi)生真菌進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，并從中分離獲得了一系列結(jié)構(gòu)新穎、藥理活性良好的海洋天然化合物[3-9]。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

美國Varian公司的INOVA-500NB超導(dǎo)核磁共振譜儀、INOVA-300NB核磁共振儀、VG ZAB-HS雙聚焦質(zhì)譜儀、Thermo DSQ電子轟擊電離質(zhì)譜儀和Thermo MAT95XP高分辨質(zhì)譜儀；北京泰克儀器有限公司的X-4數(shù)字顯示顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀。所用試劑均為廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)，化學(xué)純，溶劑經(jīng)重蒸后使用；柱層析硅膠為青島海洋化工廠生產(chǎn)的200～300目硅膠，硅膠H，薄層硅膠GF254。

1.2 菌種培養(yǎng)

紅樹林內(nèi)生真菌GX-3采自中國香港，經(jīng)鑒定為擬莖點(diǎn)霉菌（Phomopsis sp.），保存于中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院。發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖10 g/L、蛋白胨2 g/L、酵母膏1 g/L、粗海鹽2 g/L、pH 7.0。500 mL三角瓶?jī)?nèi)裝培養(yǎng)基200 mL，1.25×105 Pa 滅菌15 min后接種100 mL，在25 ℃靜置培養(yǎng)30 d。分別收集發(fā)酵液和菌體。

1.3 提取與分離

100 mL發(fā)酵物過濾得菌體和發(fā)酵液，發(fā)酵液濃縮后用乙酸乙酯充分萃取，菌體用甲醇多次浸泡。提取濃縮物分別以體積比1∶2拌硅膠（200～300目）進(jìn)行柱層析，以石油醚/乙酸乙酯/甲醇進(jìn)行梯度加壓洗脫。收集各組分再經(jīng)反復(fù)柱層析，制備薄層層析，重結(jié)晶等方法進(jìn)行純化。從菌體粗提物（約20 g）分離得到環(huán)（苯丙-甘）二肽（1）（6 mg）、環(huán)（丙-亮）二肽（2）（8 mg）、Fusaric acid （3）（10 mg）、3，6-di-sec-butyl-1，4-dihydroxypiperazine-2，5-dione（4）（5 mg）、環(huán)（脯-亮）二肽（5）（10 mg）、環(huán)（甘-亮）二肽（6）（10 mg）。

1.4 細(xì)胞毒活性試驗(yàn)

采用MTT法[10]測(cè)定化合物1對(duì)人體口腔癌KB、KBv200的抗腫瘤活性。

1.5 化合物的試驗(yàn)數(shù)據(jù)

2 結(jié)果與分析

化合物1～6的結(jié)構(gòu)圖如圖1所示。

化合物1：白色粒狀晶體， FABMS顯示分子離子峰為205[M+1]+， NMR結(jié)合質(zhì)譜，得到分子式為C11H12N2O2。1HNMR中，δ 8.07 （brs， 1H）和7.80 （brs，1H）表明存在2個(gè)酰胺質(zhì)子信號(hào)；δ 7.27 （m，3H）和7.17（m，2H）提示存在單取代苯環(huán)；δ 4.05 （dd，8.0，5.0 Hz，1H）說明存在連接雜原子的-CH；δ 3.09（dd，13.5，4.5Hz，1H）和2.89 （dd，13.5，5.0Hz，1H） 是芐亞甲基的特征；δ 3.36 （dd，17.5，3.0Hz，1H）和2.80 （d，17.5Hz，1H） mg/L的偶合常數(shù)相同，說明是連接雜原子的-CH2的2個(gè)同碳質(zhì)子。根據(jù)這些信息推出該化合物為環(huán)（甘-苯丙）二肽。進(jìn)一步與標(biāo)準(zhǔn)譜圖及文獻(xiàn)[11]對(duì)比得到確證。

化合物2：白色粉末，IR（KBr）νmax1 679、1 648/cm提示分子中存在酰胺鍵， 2個(gè)活潑氫8.09（brs，1H）， 8.00（brs，1H）證實(shí)了酰胺基的存在。δ 3.99（q，7 Hz，1H） 和δ 3.93（dd，4.5，5.5 Hz，1H）分別為連在酰胺氮上的CH，分子中有3個(gè)甲基，其中一個(gè)裂分為兩重峰δ 1.44（d，7 Hz，3H），與δ 3.99的CH相連，另外2個(gè)也裂分為雙峰，與δ 1.64（m，1H）相連， 說明分子中存在異丙基結(jié)構(gòu)。1HNMR譜中還剩下一個(gè)與δ 3.93的CH相連的CH2。根據(jù)NMR數(shù)據(jù)參照文獻(xiàn)[12]可確定其為環(huán)（丙-亮）二肽。

化合物3：無色晶體，薄層層析顯示有拖尾現(xiàn)象，可能推斷是羧酸類化合物。EIMS給出分子離子峰m/z 179，結(jié)合NMR數(shù)據(jù)分析推出分子式C10H13NO2，不飽和度為5。1HNMR中 2.7 （t，7.8 Hz，2H），1.6（m，7.8，7 Hz，2H），1.4（m，7.5，7 Hz，2H）， 0.9（t，7.5 Hz，3H） 幾組氫之間的偶合關(guān)系，表明分子中的CH3與3個(gè)CH2互相連接成一個(gè)丁基鏈，8.8（s，1H），8.2（d，8.1 Hz，1H）， 7.8 （d，8.1 Hz，1H）顯示分子中存在兩個(gè)鄰位芳香質(zhì)子和一個(gè)孤立的芳香質(zhì)子。13C NMR和 DEPT譜圖顯示10個(gè)碳，其中3個(gè)季C，3個(gè)CH，3個(gè)CH2， 1個(gè)CH3。除掉丁基鏈的4個(gè)碳外，剩余的6個(gè)碳的化學(xué)位移和類型分別為165.6 （C）、147.7（CH）、145.4（C）、143.2（C）、138.8（CH）、124.6 （CH），其中165.6（C）應(yīng)為羧酸基團(tuán)，其余5個(gè)碳同剩下的一個(gè)N對(duì)應(yīng)4個(gè)不飽和度，可推測(cè)為吡啶環(huán)。綜合以上信息，可以推測(cè)該化合物為一個(gè)取代了一個(gè)丁基和一個(gè)羧酸的吡啶。對(duì)照文獻(xiàn)[13]，確定該化合物的結(jié)構(gòu)為5-丁基-2吡啶甲酸，又名Fusaric acid。

化合物4：無色晶體，溶于甲醇。TLC碘缸顯色為泛白拖尾尖頭帶狀。EIMS顯示分子離子峰為258，結(jié)合核磁可得化合物C12H22N2O4。在13CNMR只顯示六組碳信號(hào)[161.5（C），65.8 （CH），36.3 （CH），25.8 （CH2），14.9 （CH3），12.2 （CH3）]，表明化合物存在對(duì)稱結(jié)構(gòu)。參照文獻(xiàn)[14]，確定化合物的結(jié)構(gòu)為3，6-di-sec-butyl-1，4-dihydroxypiperazine-2，5-dione，該化合物也曾在黑曲霉真菌中被分離得到過。

化合物5：白色粉末固體，溶于常見溶劑。EIMS顯示分子離子峰為210，結(jié)合核磁數(shù)據(jù)可推出該化合物的分子式為：C11H18N2O2。13CNMR和DEPT譜顯示該化合物有3個(gè)CH，4個(gè)CH2和2個(gè)CH3，3個(gè)季碳（包括兩個(gè)羰基，δ 170.1，166.1），這樣可知分子中余下一個(gè)活潑氫，δ 6.52（brs，1H）處有一個(gè)活潑氫（NH）。分子的不飽和度為4， 除去已有的2個(gè)不飽和度，還剩2個(gè)不飽和度，說明分子中存在2個(gè)環(huán)，根據(jù)所得核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]對(duì)照，基本一致，所以該化合物被確定為環(huán)（脯-亮）二肽。環(huán)（脯-亮）二肽有抗濾過性病原體、抗腫瘤的活性[16]。

化合物6：白色粉末，mp：224-226 ℃。EIMS顯示分子離子峰為170，再根據(jù)核磁數(shù)據(jù)推斷分子式為：C8H14N2O2，不飽和度為3，13CNMR和DEPT顯示1HNMR譜中有2個(gè)活潑氫信號(hào)（δ 8.20 7.91），它們可能是酰胺中的氫，δ 3.79 （1H，m）和3.63 （2H，m）分別是與N相連的CH和CH2。δ 0.89 （3H，d，J=6.9Hz）和0.87 （3H，d，J=6.9Hz）是裂分為雙重峰的2個(gè)甲基化學(xué)位移，δ 1.76 （1H，m）為次甲基CH，這些說明了分子中存在一個(gè)異丙基，13CNMR（DEPT）譜反映分子中有2個(gè)伯碳δ 22.0、23.1，2個(gè)仲碳

δ 42.1、44.2，2個(gè)叔碳δ 23.8、52.8，2個(gè)季碳δ 166.0（酮羰基）、168.3（酮羰基），不飽和度為3，說明該化合物應(yīng)該有一個(gè)環(huán)。參照標(biāo)準(zhǔn)譜圖[17]，化合物6確定為環(huán)（甘-亮）二肽。

3 小結(jié)與討論

本試驗(yàn)對(duì)南海紅樹林內(nèi)生真菌GX-3代謝產(chǎn)物進(jìn)行研究，從菌體中分離得到6個(gè)化合物：環(huán)（苯丙-甘）二肽（1）、環(huán)（丙-亮）二肽（2）、Fusaricacid（3）、3，6-di-sec-butyl-1，4-dihydroxypiperazine-2，5-dione（4）、環(huán)（脯-亮）二肽（5）、環(huán)（甘-亮）二肽（6）。初步藥理活性顯示化合物1對(duì)口腔癌細(xì)胞KB、KBv200抗腫瘤活性的LD50值分別為6.5和11.2 μmol/L。通過鑒定，所有化合物均系首次從南海紅樹林內(nèi)生真菌GX-3中分離得到。

參考文獻(xiàn)：

[1] BUGNI T S， IRELAND C M. Marine-derived fungi： A chemically and biologically diverse group of microorganisms[J]. Natural Product Reports，2004，21（1）：143-163.

[2] SADABA R B，VRIJMOED L， JONES E，et al. Observations on vertical distribution of fungi associated with standing senescent acanthus ilicifolius stems at MaiPo Mangrove， Hong Kong[J].Hydrobiologia，1995，295（1-3）：119-126.

[3] LI H X，HUANG H B，SHAO C L，et al.Cytotoxic norsesquiterpene peroxides from the endophytic fungus Talaromyces flavus isolated from the mangrove plant Sonneratia apetala[J].Journal of Natural Products，2011，74（5）：1230-1235.

[4] SHAO C L，WANG C Y，WEI M Y，et al.Aspergilones A and B，two benzylazaphilones with an unprecedentedcarbon skeleton from the gorgonian-derived fungus Aspergillus sp.[J]. Bioorganic Medicinal Chemistry Letters，2011，21（2）：690-693.

[5] WEI M Y，WANG C Y，LIU Q A，et al.Five sesquiter-penoids from a marine-derived fungus Aspergillus sp. isolated from a gorgonian Dichotella gemmacea[J]. Marine Drugs，2010，8（4）：941-949.

[6] 魏美燕，邵長(zhǎng)倫，譚 倪，等.南海海洋真菌Penicillium sp. （386#）次級(jí)代謝產(chǎn)物再研究[J]，中山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，49（4）：77-80.

[7] WEN L，CAI X L，XU F，et al.Three metabolites from the mangrove endophytic fungus Sporothrix sp.（#4335）from the South China Sea[J]. Journal of Organic Chemistry，2009，74（3）：1093-1098.

[8] SHAO C L，WANG C Y，WEI M Y，et al.Structure elucidation of two new xanthone derivatives from the marinefungus Penicillium sp.（ZZF 32#） from the South China Sea[J]. Magnetic Resonance in Chemistry，2008，46（11）：1066-1069.

[9] LIN Y C，WU X Y，F(xiàn)ENG S，et al. Five unique compounds： xyloketals from nangrove fungus Xylaria sp. from the South China Sea coast[J]. Journal of Organic Chemistry，2001，66（19）：6252-6256.

[10] MOSMANN T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival application to proliferation and cytotoxicity assays[J]. Journal of Immunological Methods，1983，65（1-2）：55-63.

[11] 吳雄宇，林永成，馮 爽，等.南海紅樹林內(nèi)生真菌1356#代謝產(chǎn)物的研究[J].熱帶海洋學(xué)報(bào)，2001，20（4）：80-86.

[12] MASAHIKO I， CHOTIKA S，MORAKOT T，et al.New resorcylic macrolides from the marine mangrove fungus Aigialus parvus[J]. The Journal of Organic Chemistry，2002，67（5）：1561-1566.

[13] RENSLO A R，DANHEISER R L. Synthesis of substituted pyridines via regiocontrolled [4+2] cycloadditions of oximinosulfonates[J]. The Journal of Organic Chemistry，1998，63（22）：7840-7850.

[14] GARSON M J， JENKINS S M，STAUNTON J，et al.Isolation of some new 3，6-dialkyl-7，4-dihydroxypiperazine-2，5-diones from Aspergillus terreus[J]. J Chem Soc Trans 1，1986， 6：901-903.

[15] 汪有初，周 俊，譚寧華，等.五味子的環(huán)二肽及其合成[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1999，34（1）：19-22.

[16] RHEE K H. Cyclic dipeptides exhibit synergistic，broad spectrum antimicrobial effects and have anti-mutagenic properties[J]. International Journal of Antimicrobial Agents，2004，24（5）：423-427.

[17] 李德海，顧謙群，朱偉明，等.海洋放線菌11014中抗腫瘤活性成分的研究 I.環(huán)二肽[J].中國抗生素雜志，2005，30（8），449-452.