摘要：對(duì)采自四川省攀西地區(qū)8個(gè)縣市14個(gè)采樣點(diǎn)的22株蠶豆根瘤菌進(jìn)行耐鹽、耐酸堿、抗生素抗性和耐高溫或低溫等抗逆性測(cè)定，結(jié)果表明，供試菌株普遍耐鹽性差，僅有4株菌株能在10 g/L NaCl上生長(zhǎng)，其中2株菌株能在50 g/L NaCl上生長(zhǎng)；供試菌株對(duì)酸堿的耐性比較強(qiáng)，所有菌株都能在pH 5.0～10.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)，68.2%的菌株能在pH 4.0～12.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)；對(duì)溫度的適應(yīng)范圍較寬，63.6%的菌株既能耐受8 ℃低溫，又能耐受60 ℃高溫?zé)峒?0 min；對(duì)抗生素的抗性表現(xiàn)為氨芐青霉素>氯霉素>紅霉素>四環(huán)素>慶大霉素>卡那霉素。篩選出2株耐鹽、耐酸堿、生長(zhǎng)溫度范圍廣和耐抗生素較強(qiáng)的菌株，分別為B1和B3。

關(guān)鍵詞：蠶豆根瘤菌；抗逆性；攀西地區(qū)

中圖分類號(hào)：S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）11-2516-03

攀西地區(qū)位于長(zhǎng)江上游，處川西南地區(qū)、橫斷山脈系，屬青藏高原、云貴高原向四川盆地的過(guò)渡帶，地勢(shì)西北高、東南低，相對(duì)高度5 653 m[1]。該地區(qū)光資源豐富，具有典型的南亞熱帶河谷氣候特征和山區(qū)立體氣候特點(diǎn)，境內(nèi)不僅現(xiàn)有生物資源豐富，而且具有引種、培育熱帶和寒帶多種動(dòng)植物的條件[2]。

蠶豆是世界上重要的豆科作物，是中國(guó)重要的糧食、蔬菜、副食、飼料、綠肥和養(yǎng)地作物[3]。四川栽培蠶豆有2 000多年的歷史，年種植蠶豆約30萬(wàn)hm2[4]，其中涼山、阿壩、甘孜三州生產(chǎn)的大白蠶豆品質(zhì)好，部分產(chǎn)品以原糧出口創(chuàng)匯，是高原山區(qū)的主要增收作物[5]。蠶豆共生體——根瘤菌能夠固定空氣中的氮合成氨，供植物生長(zhǎng)需要，但其共生固氮受到環(huán)境條件的限制[6，7]，并有研究指出，某種特殊根瘤菌群的出現(xiàn)與適當(dāng)?shù)乃拗鞫箍浦参?、土壤溫度、土壤酸堿度、土壤水分含量等有明顯的相關(guān)性[8]。研究對(duì)攀西地區(qū)8個(gè)縣市的14個(gè)采樣點(diǎn)分離的22株蠶豆根瘤菌進(jìn)行耐鹽性、生長(zhǎng)溫度、生長(zhǎng)pH范圍以及對(duì)抗生素抗性的測(cè)定，為篩選適宜攀西地區(qū)環(huán)境的高效蠶豆根瘤菌及其遺傳多樣性的研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

從四川省攀西地區(qū)8個(gè)縣市14個(gè)采樣點(diǎn)分離得到22株蠶豆根瘤菌，水培回接全部結(jié)瘤，供試菌株情況見(jiàn)表1。

1.2 抗逆性試驗(yàn)

1.2.1 耐鹽性測(cè)定 在YMA培養(yǎng)基上進(jìn)行供試菌株的活化培養(yǎng)，后接種于NaCl濃度分別為10、20、30、40和50 g/L的YMA培養(yǎng)基上，以含0.2 g/L NaCl的YMA培養(yǎng)基為對(duì)照，重復(fù)3次，28 ℃培養(yǎng)7 d觀察記錄，生長(zhǎng)記為“+”，不生長(zhǎng)記為“-”。

1.2.2 耐酸堿性測(cè)定 以pH 7的YMA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH分別為4.0、5.0、6.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，然后將供試菌株接種于不同pH的培養(yǎng)基上，以pH 7.0的培養(yǎng)基為陽(yáng)性對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)7 d，觀察及記錄方法同1.2.1。

1.2.3 生長(zhǎng)溫度范圍測(cè)定 將活化純化的菌株接種于YMA培養(yǎng)基上，分別在8、28、37和60 ℃（其中，37 ℃和60 ℃是指在此溫度下熱激處理30 min后于28 ℃下培養(yǎng)）下培養(yǎng)7 d，以28 ℃為陽(yáng)性對(duì)照，觀察及記錄方法同1.2.1。

1.2.4 抗生素抗性測(cè)定 選取氨芐青霉素（Amp）、慶大霉素（Gm）、紅霉素（Em）、氯霉素（Cm）、四環(huán)素（Tc）和卡那霉素（Km）6種抗生素，每種抗生素終濃度分別設(shè)定為5、50、100、300 μg/mL 4個(gè)濃度梯度。每種抗生素經(jīng)細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾除菌后，加入到經(jīng)高溫滅菌處理后冷卻至50 ℃左右的YMA培養(yǎng)基中，制成平板，以不加抗菌素的YMA平板為對(duì)照，培養(yǎng)觀察及記錄方法同1.2.1。

以上試驗(yàn)均采用點(diǎn)接種法，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鹽性測(cè)定結(jié)果

供試的蠶豆根瘤菌對(duì)NaCl的耐性普遍較差，81.8%的菌株不能在含10～50 g/L NaCl的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，僅有4株菌株能在含10 g/L NaCl的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，分別為B1、B2、B3和B15，其中菌株B1、B3還能在試驗(yàn)所設(shè)其他濃度（30～50 g/L）的含NaCl的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，具有較好的耐鹽性。比王慶等[9]測(cè)得的蠶豆根瘤菌的耐鹽生長(zhǎng)范圍0.1～0.3 mol/L（5.8～17.6 g/L）廣；刁治民等[10]對(duì)青海蠶豆根瘤菌進(jìn)行耐鹽回接試驗(yàn)表明，在營(yíng)養(yǎng)液NaCl濃度為0.1 mol/L（5.8 g/L）時(shí)已經(jīng)不結(jié)瘤；何恒斌等[11]對(duì)沙冬青根瘤菌進(jìn)行的耐鹽試驗(yàn)指出，在鹽漬化灘地采集到的根瘤菌能耐受70 g/L的NaCl。不同菌株耐鹽性差異可能與菌株生長(zhǎng)的地理環(huán)境有關(guān)。

2.2 耐酸堿性測(cè)定結(jié)果

供試蠶豆根瘤菌對(duì)酸堿的耐性范圍較廣，不同的菌株對(duì)酸堿的耐性存在差異。試驗(yàn)結(jié)果表明，所有供試菌株均能夠在pH 5.0～10.0的范圍內(nèi)生長(zhǎng)；除B5不能在低pH（pH 4.0）下生長(zhǎng)，B4、B11、B12、B16、B17不能在pH 11.0和pH 12.0下生長(zhǎng)， B19不能在pH 12.0下生長(zhǎng)外，其他菌株（占菌株總數(shù)的68.2%）均能在pH 4.0～12.0的范圍內(nèi)生長(zhǎng)。

2.3 生長(zhǎng)溫度范圍測(cè)定結(jié)果

溫度是重要的生態(tài)因子之一，影響固氮酶活性，針對(duì)蠶豆根瘤菌生長(zhǎng)溫度范圍的測(cè)定還少見(jiàn)報(bào)道。徐開(kāi)未等[12]對(duì)金沙河谷區(qū)山螞蝗屬根瘤菌進(jìn)行溫度范圍測(cè)定結(jié)果表明，在4 ℃也有根瘤菌生長(zhǎng)。一般認(rèn)為根瘤菌的最適生長(zhǎng)溫度為25～30 ℃，60 ℃高溫下5 min會(huì)全部被殺死，只有極少數(shù)根瘤菌能生長(zhǎng)在4 ℃的條件下[13]。此次試驗(yàn)供試蠶豆根瘤菌生長(zhǎng)溫度范圍較廣。有81.8%的菌株能在8 ℃的條件下生長(zhǎng)，全部菌株能在37 ℃熱激30 min處理后生長(zhǎng)，77.3%的菌株能在60 ℃熱激30 min處理后生長(zhǎng)。其中，B2不能在低溫（8 ℃）和高溫（60 ℃）熱激處理后生長(zhǎng)，B4、B13、B16、B18不能在高溫?zé)峒ぬ幚砗笊L(zhǎng)，B7、B14、B17不能在低溫條件下生長(zhǎng)。由此可知，有63.6%的菌株既能耐受8 ℃的低溫，又能耐受60 ℃的高溫?zé)峒?。試?yàn)菌株具有較廣的生長(zhǎng)溫度范圍可能與攀西地區(qū)南亞熱帶氣候以及高山所形成的垂直氣候分布有關(guān)。

2.4 抗生素抗性測(cè)定結(jié)果

2.4.1 卡那霉素 供試蠶豆根瘤菌對(duì)卡那霉素都很敏感，沒(méi)有一株根瘤菌能在設(shè)定的最低濃度的卡那霉素平板上生長(zhǎng)。

2.4.2 慶大霉素 供試蠶豆根瘤菌對(duì)慶大霉素的抗性強(qiáng)于卡那霉素。有27.3%的菌株能在濃度為50 μg/mL的慶大霉素平板上生長(zhǎng)，18.2%的菌株能在100 μg/mL的慶大霉素平板上生長(zhǎng)，有1株菌株能在300 μg/mL的慶大霉素平板上生長(zhǎng)。其中，B4、B6能在5～50 μg/mL的慶大霉素平板上生長(zhǎng)，B12、B16、B17能在5～100 μg/mL的慶大霉素平板上生長(zhǎng)，B19能在試驗(yàn)所設(shè)的所有濃度（5～300 μg/mL）范圍內(nèi)生長(zhǎng)，對(duì)慶大霉素抗性最強(qiáng)。

2.4.3 四環(huán)素 供試菌株對(duì)四環(huán)素耐受能力較差。除B4、B11、B12、B16、B17和B19外，其他所有菌株均能在低濃度（5 μg/mL）四環(huán)素平板上生長(zhǎng)，占到72.7%；僅有1株根瘤菌（B3）能在試驗(yàn)所設(shè)的所有四環(huán)素濃度（5～300 μg/mL）范圍內(nèi)生長(zhǎng)，對(duì)四環(huán)素表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗性。

2.4.4 紅霉素 供試蠶豆根瘤菌對(duì)紅霉素的抗性強(qiáng)于前3種抗菌素。全部根瘤菌均能在5 μg/mL的紅霉素平板上生長(zhǎng)，31.8%的菌株能在50 μg/mL紅霉素的平板上生長(zhǎng)，13.6%的菌株能耐受100 μg/mL的紅霉素，僅1株菌株能耐受300 μg/mL的紅霉素。其中，B1能在試驗(yàn)所設(shè)所有紅霉素濃度（5～300 μg/mL）范圍內(nèi)生長(zhǎng)，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗性；B3、B15能在5～100 μg/mL的紅霉素平板上生長(zhǎng)；B7、B19、B20、B21能在5～50 μg/mL的紅霉素平板上生長(zhǎng)。

2.4.5 氯霉素 供試蠶豆菌株對(duì)氯霉素的抗性較強(qiáng)，所有菌株均能在5 μg/mL的氯霉素平板上生長(zhǎng)，86.4%的菌株能在50 μg/mL的氯霉素平板上生長(zhǎng)，72.7%的菌株能耐受100 μg/mL的氯霉素，僅1株菌株能耐受300 μg/mL的氯霉素。其中，B1、B12和B17耐受性較差，僅能在5 μg/mL氯霉素平板上生長(zhǎng)；B2、B5和B20能在5～50 μg/mL的氯霉素下生長(zhǎng)；B21能在試驗(yàn)所設(shè)所有氯霉素濃度（5～300 μg/mL）范圍生長(zhǎng)，耐受性最強(qiáng)；其他均能在5～100 μg/mL的氯霉素范圍內(nèi)生長(zhǎng)。

2.4.6 氨芐青霉素 供試蠶豆根瘤菌對(duì)氨芐青霉素最不敏感，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗性。所有供試菌株均能夠在含5 μg/mL氨芐青霉素的平板上生長(zhǎng)，95.5%的菌株（除B11外的所有菌株）能生長(zhǎng)于含50 μg/mL氨芐青霉素的平板上，77.3%的菌株（除B4、B11、B12和B17外的菌株）能夠耐受100 μg/mL的氨芐青霉素，在含300 μg/mL氨芐青霉素的平板上仍然有72.7%的菌株（另除B16外的菌株）能夠生長(zhǎng)。B11對(duì)氨芐青霉素最敏感。

綜上可知，供試蠶豆根瘤菌對(duì)抗生素的抗性普遍表現(xiàn)為氨芐青霉素>氯霉素>紅霉素>四環(huán)素>慶大霉素>卡那霉素，不同的菌株有不同的抗性，同一菌株對(duì)不同抗生素的抗性不同，對(duì)同一種抗生素，隨著濃度的增大抗性也越來(lái)越弱。此結(jié)果與徐開(kāi)未等[14]、何恒斌等[11]的研究結(jié)果相一致。根瘤菌對(duì)抗菌素的抗性可以作為分群的指標(biāo)之一。韋革宏等[15]對(duì)河南省采集的根瘤菌進(jìn)行的抗菌素抗性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在低濃度的抗生素中大多數(shù)根瘤菌都能生長(zhǎng)，在300 μg/mL的紅霉素、卡那霉素、慶大霉素中沒(méi)有1株根瘤菌生長(zhǎng)，僅有7株根瘤菌能在300 μg/mL的青霉素中生長(zhǎng)。韋革宏等[16]對(duì)山東省根瘤菌抗菌素抗性研究結(jié)果表明，32%的菌株對(duì)300 μg/mL的青霉素具有耐性。可見(jiàn)，來(lái)自不同地理環(huán)境的根瘤菌對(duì)抗菌素的抗性存在差異。研究篩選出了針對(duì)不同抗菌素有較強(qiáng)抗性的菌株， B1、B3、B19、B21分別能在300 μg/mL的紅霉素、四環(huán)素、慶大霉素、氯霉素上生長(zhǎng)，表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗性。

3 小結(jié)

對(duì)采自攀西地區(qū)8個(gè)縣市14個(gè)采樣點(diǎn)經(jīng)水培驗(yàn)證的22株蠶豆根瘤菌的4項(xiàng)抗逆性指標(biāo)進(jìn)行分析后得出，菌株對(duì)鹽的耐性普遍較差，只有4株（B1、B2、B3、B15）菌株能在含10 g/L NaCl的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，但仍有2株菌株（B1、B3）能在高濃度（50 g/L）NaCl條件下生長(zhǎng)。菌株具有較強(qiáng)的耐酸堿性，所有菌株都能在pH 5.0～10.0的范圍內(nèi)生長(zhǎng)，68.2%的菌株能在pH 4.0～12.0的范圍內(nèi)生長(zhǎng)。對(duì)于溫度的耐性也比較強(qiáng)，有63.6%的菌株能耐受8 ℃的低溫和60 ℃的高溫?zé)峒ぃ峒?0 min），可能是與該地區(qū)特殊的氣候條件有關(guān)。對(duì)抗生素的抗性表現(xiàn)為氨芐青霉素>氯霉素>紅霉素>四環(huán)素>慶大霉素>卡那霉素，除卡那霉素外，均篩選出了能抗高濃度（300 μg/mL）抗生素的菌株。

所有的菌株中，B1、B3能耐受高濃度（50 g/L）的NaCl，能在pH 4.0～12.0范圍內(nèi)生長(zhǎng)，能耐受8 ℃的低溫和60 ℃的高溫?zé)峒?，B1菌株能夠在含300 μg/mL紅霉素的平板上生長(zhǎng)，B3菌株能在300 μg/mL四環(huán)素條件下生長(zhǎng)。因此，這2株菌株為篩選出來(lái)的抗逆性較強(qiáng)的優(yōu)良菌株。

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