【摘要】目的：觀察卵巢早衰模型小鼠卵巢組織內Treg和Foxp3基因表達水平的變化及右歸丸的干預作用。方法：采用透明多肽建立小鼠自身免疫性卵巢早衰模型。RT-PCR法檢測卵巢組織Treg和Foxp3基因表達水平。結果：模型組Treg和Foxp3基因表達水平均明顯下降，與正常組相比有顯著差異性（p<0.01）；右歸組Treg和Foxp3基因表達水平均明顯增高，與正常組比較無統(tǒng)計學意義（p>0.05）；西藥組Treg和Foxp3基因表達水平與模型組比較無統(tǒng)計學意義（p>0.05）。結論：卵巢早衰的組織損傷可能與Treg和Foxp3基因表達水平下降對自身免疫反應的抑制降低導致，而右歸丸可通過上調Treg和Foxp3基因表達水平來誘導自身免疫耐受和抑制自身免疫性卵巢損傷。

【關鍵詞】右歸丸；卵巢早衰；調節(jié)性T細胞；叉頭狀蛋白3

【中圖分類號】R453【文獻標識碼】A【文章編號】1004-4949（2013）11-210-03

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指性器官發(fā)育正常的女性在40歲以前出現閉經，伴卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）和黃體生成素（luteinizing hormone，LH）水平升高，雌激素（estradiol， E2）水平降低，卵泡數量減少，卵巢體積縮小并最終萎縮的卵巢功能衰退現象。發(fā)病率約為1%～3%。大約10%～30%的POF是由于免疫系統(tǒng)不能識別自身卵巢組織所致，該類患者常合并多種自身免疫性疾病。自身免疫性POF可能與Treg細胞數目減少有關。中醫(yī)認為腎虛，腎的陰陽平衡失調是POF的根本病機。右歸丸作為補腎中藥中“陰中求陽”代表方，臨床證實該方治療不孕癥、更年期綜合征、骨質疏松療效顯著[1]。本實驗采用RT-PCR法觀察卵巢早衰模型小鼠卵巢組織內Treg和Foxp3基因表達水平的變化，并予右歸丸治療，觀察右歸丸對卵巢早衰模型小鼠Treg和Foxp3基因表達水平的影響。

1材料

1.1實驗動物： SPF級BALB/c雌性小鼠72只，1月齡，體重18～22g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，中國科學院上海實驗動物中心檢驗。許可證號為CXK（湘）2009-0004。雌雄小鼠按6：1比例同籠隔開飼養(yǎng)以誘導正常動情周期。

1.2藥物與主要試劑

1.2.1小鼠透明帶3多肽片段（pZP3），為透明帶3的第330-342個氨基酸，其序列為：Asn-Ser-Ser-Ser-Ser-Gln-Phe-Gln-Ile-His-Gly-Pro-Arg，經過HPLC分析純度>90%，購自杭州中胎生化有限公司。弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，均購自美國Sigma公司。

1.2.2右歸丸中藥飲片由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院提供，交由湖南中醫(yī)藥大學藥學院生物工程實驗室制成中藥水提純液；戊酸雌二醇片（補佳樂片）規(guī)格為1mg/片，由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院提供，DELPHARM Lille S.A.S公司生產，國藥準字號：J20080036。產品批號：202A；醋酸甲羥孕酮片（安宮黃體酮片）規(guī)格為2mg/片，由湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院提供，浙江仙琚制藥股份有限公司生產，國藥準字號：H33020715，批號：100913。

1.2.3一步法RT-PCR試劑盒（寶生物工程有限公司）；Trioz（國藥集團化學試劑有限公司）；100bp標準DNA分子量（美國Pormega公司）；焦碳酸二乙酯（DEPC）（國藥集團化學試劑有限公司）引物合成：由上海生工生物工程公司合成。（Treg引物：上游：5’-AAGTAGAAGAGGGCAACC-3，下游：5’-GGTCTGCTGACCTCCTTGTG-3；FOXP3引物：上游：5’-TACCACTGGTTCACACGCATGT-3’，下游：5’-CACCCGCACAAAGCACTTG-3’；內參β-actin引物：上游：5’--ACCGTGAAAAGATGACCCAG-3’，下游：5’-ATTGTAACCAACTGGGACG-3。）

1.3主要儀器： 金諾天平儀器有限公司的電子天平；Derby低溫冰箱；美國Thermo公司紫外分光光度儀；美國Thermo公司DNA熱循環(huán)擴增儀；美國Startganee公司凝膠掃描成像分析系統(tǒng)；麥克奧迪實業(yè)集團公司Mot1cBS顯微攝像系統(tǒng)；美國ThermoPxZ型PCR儀；北京六一公司電泳儀等。

2方法

2.1 POF模型建立： 將購得的1月齡小鼠常規(guī)喂養(yǎng)1W適應新環(huán)境后進行造模。小鼠自身免疫性POF模型建立參照文獻方法[2]：稱取4mg ZP3透明帶多肽粉末，加入4mL三蒸水配成溶液，取2mL溶液稀釋至12mL溶液，與弗氏完全佐劑按1：1比例配制成24ml免疫試劑，另取2mL溶液稀釋至12mL與弗氏不完全佐劑按1：1比例配制成24mL免疫強化試劑。實驗組各取0.15mL免疫試劑皮下多點注射雙后腳掌及腹腔，2W后以免疫強化試劑0.15mL皮下多點注射小鼠雙后腳掌及腹腔加強免疫。正常組雙后腳掌及腹腔皮下多點注射生理鹽水。第二次造模結束后連續(xù)7d陰道脫落細胞檢查，并每組隨機抽取2只小鼠處死，眼眶采血，觀察卵巢重量、組織形態(tài)學及血清性激素水平的改變確定造模是否成功。若造模不成功則繼續(xù)予免疫強化劑注射，各檢測同前。

2.2 分組及給藥

2.2.1 分組： 按體重分層后將72只小鼠均衡的分為4組，每組18只（根據中藥一般藥理學研究技術指導原則中每組不少于10只和動物實驗過程中出現死亡的可能，故設每組18只），設其中一組為正常組。造模成功后再將剩余自身免疫性卵巢早衰小鼠按體重分層后以隨機區(qū)組法分成3組，分別為：模型組、右歸丸組（簡稱右歸組）、雌孕激素序貫療法對照組（簡稱西藥組）。正常組不變。

2.2.2 給藥： 右歸組于確定造模成功后第2天予每日每20克小鼠0.2mL（藥物濃度0.16g/ml）右歸丸水提純液灌胃，每日1次。6d一療程，每6d休息1d，共4療程；西藥組于造模成功后第2日開始每4d予每20g小鼠西藥補佳樂0.2mL（藥物濃度0.017mg/mL）灌胃，第4d每20g小鼠加用安宮黃體酮0.2mL（藥物濃度0.1365mg/mL）。4d一療程，每4d休息1d，共6療程；正常組和模型組每日予每20g小鼠0.2mL蒸餾水灌胃。灌胃療程如前。所有小鼠灌胃一周后重新稱重以調整用藥劑量。

2.3實驗取材： 所有動物末次給藥后禁食12h，乙醚麻醉，眶靜脈取2mL全血，取血后斷頸處死小鼠，在放有大量冰塊的超凈工作臺取出雙卵巢，冰凍生理鹽水洗凈，濾紙干燥后稱重，立即置液氮罐中冷凍，待行RT-PCR檢測。

2.4 卵巢組織Treg和Foxp3蛋白表達水平的檢測： 先提取卵巢組織中總RNA，鑒定RNA純度、測定RNA濃度并鑒定RNA完整性。然后一步法擴增RT-PCR。擴增條件：50℃，30min；94℃預變性2min；性94℃30s。，復性（Th17 58℃/Treg 60℃），30s；延伸72℃ lmin，共進行30個循環(huán)。最后進行RT-PCR產物的檢測及半定量分析（取6μl擴增產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，恒壓80v，電泳1h，紫外燈下分析PCR結果，并用凝膠成像分析系統(tǒng)測定灰度值，計算Treg或Foxp3/β-actin的比值，以獲得目的片段的相對表達量。）

2.5 統(tǒng)計學分析： 本實驗全部數據均采用SPSS18.0軟件包進行統(tǒng)計學處理，計量資料以均數±標準差（X±s）表示。對于滿足正態(tài)分布、方差齊性的指標，采用單因素方差分析（AVOVA），對于方差不齊的數據用Tamhane’sT2法。（檢驗水準α=0.05，P>0.05表示無統(tǒng)計學意義；P<0.05說明有統(tǒng)計學意義；P<0.01表示有顯著統(tǒng)計學意義）

3結果

3.1一般情況： 實驗用鼠原共有72只，造模時意外死亡2只，三次檢測造模是否成功，處死12只，灌胃時意外死亡5只，累計死亡19只，剩余53只。小鼠造模開始后第一周出現不同程度的體重下降，四肢無力，體毛晦暗無光澤，行動遲緩，進食減少，二便減少。藥物干預一月后：模型組大鼠表現為弓背，喜蜷縮，反應淡漠，活動減少，毛色黯無光澤，但體重與正常組比較無明顯差異；治療組大鼠與模型組大鼠相比飲水、進食正常，精力好，活動靈敏、毛色潤澤光亮。

3.2免疫性POF小鼠Treg和Foxp3基因表達水平及右歸丸的影響（見表1）： 正常組與模型組相比Treg和Foxp3基因表達水平均有顯著差異（P<0.01），正常組與右歸組和西藥組比較，Treg基因表達無統(tǒng)計學意義（P>0.05）；正常組與西藥組比較Foxp3基因表達有差異（P<0.05）；模型組與右歸組和西藥組比較無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。